Изоляция цереброспинальной жидкости из грызунов эмбрионов для использования с расчлененный коры головного мозга Экспланты
Summary
Жидкостью желудочка спинномозговая (CSF) купается нейроэпителиальных и коры головного мозга клеток-предшественников на ранних стадиях развития мозга у зародыша. Здесь мы опишем метод, разработанный, чтобы изолировать желудочка CSF от грызунов эмбрионов разного возраста с целью изучения его биологической функции. Кроме того, мы демонстрируем нашу коры головного мозга рассечение эксплантов и культуры техника, которая позволяет эксплантов роста с минимальными объемами культуральной среды или CSF.
Abstract
CSF представляет собой сложную жидкость с динамически меняющейся протеома в ходе развития и в зрелом возрасте. Во время эмбрионального развития, зарождающиеся CSF отличается от амниотической жидкости после закрытия передней части нервной трубки. CSF объем увеличивается, то в последующие дни, как нейроэпителиальных клеток-предшественников, выстилающих желудочки и сосудистые сплетения порождают CSF. Эмбриональных контакты CSF апикальной, желудочковой поверхности нервные стволовые клетки развивающегося мозга и спинного мозга. CSF предоставляет важную давление жидкости для расширения развивающегося мозга и распространяет важные факторы роста в нейронных клеток-предшественников в конкретной временной основе. Для исследования функции CSF, важно, чтобы изолировать чистых образцов эмбриональных CSF без загрязнения из крови или тканей развивается конечного мозга. Здесь мы описываем технику с целью изолировать сравнительно чистых образцов желудочка эмбрионального CSF, который может быть использован дляШирокий спектр экспериментальных тестов, включая масс-спектрометрии, электрофореза белков и клеток и первичной культуре эксплантов. Мы демонстрируем, как анализировать и культуры корковых эксплантов на пористых мембран поликарбоната для того, чтобы расти развивающиеся корковой ткани с сокращением объемов средств массовой информации или CSF. С помощью этого метода, эксперименты можно проводить с использованием CSF от разных возрастов и условиях для исследования биологической активности CSF протеома на клетки-мишени.
Introduction
CSF представляет собой сложную жидкость, которая омывает развивающихся нейроэпителия 1-6 и обеспечивает необходимую 7 давления и стимуляции роста сигналы для развивающегося мозга 8-12. Для изучения CSF в течение развития мозга, мы разработали методы, чтобы изолировать желудочка CSF из развивающихся крысы или мыши эмбрионов на разных стадиях развития 6,9. Предыдущие методы выделения включены использованием стекла микро-иглы и выделения CSF помощью микро-форсунка 1,2. Наш метод использует стеклянные микро-капиллярной пипетки вершина которого была вытащил для создания ультратонких точкой для улучшения проникновения в ткани. Стеклянные микро-капиллярной пипетки связано с аспиратором, так что коллекция желудочка CSF можно управлять с нежным изменения давления. Для исследования стволовых клеток влияния сигналов CSF, мы проанализируем коры головного мозга эксплантов, разместить их на мембранах из поликарбоната, и они плавали на соответствующих у.е.lture среде с добавлением образцы спинномозговой жидкости 9. С помощью этой техники, снижение объемов средств массовой информации достаточно для культуры тканей, что позволяет эффективно использовать CSF 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный метод сбора желудочка CSF дала относительно чистых образцов эмбриональных CSF со стабильным составом белков и последовательную деятельность в ряде клеточных анализов 9. С хорошей техникой сбора и размер помета из десяти E14.5 мышей, можно ожидать, собрать 10-15 мкл спинномозг?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за поддержку со стороны NIH (премия номера R00 NS072192 в MKL, HD029178 в AS.L. и 2 RO1 NS032457 в CAW). MKL является получателем Детской больницы Бостона развития карьеры стипендий / Гарвардской медицинской школы стипендии Shore и членом Alfred P. Sloan Foundation. CAW является следователь Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Biologie du développement. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Biologie du développement. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Biologie du développement. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
