Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo's voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten
Summary
De ventriculaire cerebrospinale vloeistof (CSF) baadt de neuro-epitheliale en cerebrale corticale progenitorcellen tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen in het embryo. Hier beschrijven we de methode ontwikkeld om ventriculaire CSF isoleren van knaagdieren embryo's van verschillende leeftijden om zijn biologische functie onderzoeken. Daarnaast tonen wij onze cerebrale corticale explantatie dissectie en cultuur techniek die voor explantatie groei mogelijk maakt met een minimale hoeveelheid voedingsoplossing of liquor.
Abstract
Het CSF is een complexe vloeistof met een dynamisch variërende proteoom tijdens de ontwikkeling en in de volwassenheid. Tijdens de embryonale ontwikkeling de ontluikende CSF opzichte van het vruchtwater na sluiting van de voorste neurale buis. CSF volume neemt dan de daaropvolgende dagen als de neuro-epitheliale stamcellen langs de ventrikels en de choroidea plexus genereren CSF. De embryonale CSF contacten de apicale, ventriculaire oppervlak van de neurale stamcellen van de ontwikkelende hersenen en het ruggenmerg. CSF biedt cruciaal vloeistofdruk voor de uitbreiding van de zich ontwikkelende hersenen en distribueert belangrijke groeibevorderende factoren om neurale progenitorcellen in een tijdelijk-specifieke wijze. Het onderzoeken van de functie van de CSF, is het belangrijk om zuivere monsters van embryonale CSF isolaat zonder contaminatie van bloed of de ontwikkeling telencephalic weefsel. Hier beschrijven we een techniek relatief zuivere monsters van ventriculaire embryonale CSF dat gebruikt kan worden voor isolerendiverse experimentele proeven, waaronder massaspectrometrie, eiwit elektroforese, en cellen en primaire explantaatkweek. We laten zien hoe te ontleden en cultuur corticale explantaten op poreuze polycarbonaat membranen om de ontwikkeling van corticale weefsel groeien met verminderde volumes van media of CSF. Met deze methode kunnen experimenten uitgevoerd met CSF van verschillende leeftijden of voorwaarden om de biologische activiteit van de CSF proteoom onderzoeken op doelcellen.
Introduction
Het CSF is een complexe vloeistof die de ontwikkeling van neuro-epitheel één-zes baadt en biedt essentiële druk 7 en groeibevorderende aanwijzingen voor de zich ontwikkelende hersenen 8-12. Om de CSF te bestuderen in de loop van ontwikkeling van de hersenen, we technieken ontwikkeld om ventriculaire CSF te isoleren van het ontwikkelen van rat of muis embryo's tijdens de verschillende stadia van ontwikkeling 6,9. Vorige methoden van isolatie opgenomen met behulp van een glazen micro-naald en het isoleren van de CSF met behulp van een micro-injector 1,2. Onze methode maakt gebruik van een glazen micro-capillaire pipet wiens tip is getrokken om een ultrafijne punt voor een betere penetratie te creëren. De glazen micro-capillaire pipet is verbonden met een aspirator zodat ventriculaire CSF verzameling kan worden bediend met lichte veranderingen in druk. Om de stamcellen invloeden van CSF signalen te onderzoeken, ontleden we cerebrale corticale explantaten, leg ze op polycarbonaat membranen, en drijven ze op juiste culture medium aangevuld met CSF monsters 9. Met deze techniek verminderde hoeveelheden media cultuur voldoende zijn om het weefsel, waardoor een efficiënt gebruik van CSF 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven werkwijze voor ventriculaire CSF collectie leverde relatief zuivere monsters van embryonale CSF met stabiele en consistente eiwitsamenstelling activiteit in een aantal cellulaire assays 9. Met een goede techniek voor het verzamelen en worpgrootte van tien E14.5 muizen, kan men verwachten tot 10-15 ul CSF te verzamelen en uit een nest van E16 ratten, kan men verwachten te verzamelen ca 50-90 ul van CSF. Deze collectie techniek minimaliseert vervuiling door bloed en weefsel, door zorgvuldige obser…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de steun van het NIH (Award nummers R00 NS072192 aan MKL, HD029178 om AS.L., en 2 RO1 NS032457 naar CAW). MKL is de ontvanger van de Children's Hospital Boston Career Development Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship en een Fellow van de Alfred P. Sloan Foundation. CAW is een onderzoeker van de Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Biologie du développement. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Biologie du développement. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Biologie du développement. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
