Isolement du liquide céphalo-rachidien à partir d'embryons de rongeurs pour une utilisation avec des explants cérébraux corticaux disséqué

Summary

Le fluide ventriculaire céphalo-rachidien (LCR) baigne les cellules neuro-épithéliales corticales et progénitrices cérébrale au cours du développement précoce du cerveau chez l'embryon. Nous décrivons ici la méthode mise au point pour isoler le LCR ventriculaire à partir d'embryons de rongeurs d'âges différents afin d'étudier sa fonction biologique. En outre, nous démontrons notre dissection cérébrale corticale explant et la technique de culture qui permet la croissance des explants avec des volumes minimaux de milieu de culture ou le LCR.

Abstract

Le LCR est un liquide complexe avec un protéome de faire varier dynamiquement au cours du développement et chez l'adulte. Au cours du développement embryonnaire, le CSF naissante différencie du liquide amniotique lors de la fermeture du tube neural antérieur. Le volume de LCR augmente alors que les jours qui suivirent les cellules souches neuro-épithéliales qui tapissent les ventricules et le plexus choroïde générer LCR. Les contacts embryonnaires LCR de la surface apicale ventriculaire, des cellules souches neurales du cerveau en développement et la moelle épinière. CSF fournit une pression de fluide essentiel pour le développement du cerveau en développement et distribue croissance importante de facteurs favorisant cellules progénitrices neurales d'une manière temporellement spécifique. Pour étudier la fonction de la LCR, il est important d'isoler des échantillons purs de CSF embryonnaire sans contamination par le sang ou le tissu développer télencéphalique. Nous décrivons ici une technique pour isoler des échantillons relativement purs du ventricule embryonnaire CSF qui peuvent être utilisés pourun grand nombre de tests de laboratoire dont la spectrométrie de masse, électrophorèse des protéines, et la culture de cellules et explant primaire. Nous démontrons comment disséquer et à la culture des explants de cortex sur des membranes de polycarbonate poreux pour grandir développer le tissu cortical avec des volumes réduits de médias ou le LCR. Avec cette méthode, les expériences peuvent être effectuées en utilisant le LCR de différents âges ou de conditions d'enquêter sur l'activité biologique du protéome CSF sur les cellules cibles.

Introduction

Le LCR est un liquide complexe qui baigne le développement neuro-épithélium ^1-6 et fournit ^une pression de ⁷ essentiels et de promouvoir la croissance des indices pour le développement du cerveau ^8-12. Pour étudier le CSF au cours du développement du cerveau, nous avons développé des techniques pour isoler le LCR ventriculaire du développement des embryons de rat ou de la souris pendant divers stades de développement ^6,9. Les méthodes précédentes de l'isolement à l'aide d'un verre inclus micro-aiguille et l'isolement de la peste porcine classique en utilisant un micro-injecteur ^1,2. Notre méthode utilise un verre micro-pipette capillaire dont la pointe a été retiré pour créer un point ultrafin pour la pénétration tissulaire améliorée. Le verre micro-pipette capillaire est relié à un aspirateur de sorte que la collecte CSF ventriculaire peut être commandé avec des modifications de la pression douce. Pour étudier l'influence de cellules souches de signaux CSF, nous disséquer cérébrales corticales explants, les placer sur des membranes de polycarbonate, et les faire flotter sur la cu appropriéesmoyen lture complétée par des échantillons de LCR ^9. Avec cette technique, la baisse des volumes de médias sont suffisants pour la culture des tissus, ce qui permet une utilisation efficace des CSF ^9.

Protocol

1. Isolation embryon / Préparation Cette technique peut être utilisée pour la souris ou le rat. Dans ce protocole, nous allons démontrer la technique de collecte de CSF et cérébrale corticale dissection explant avec la souris embryonnaire du cerveau. Nous allons commenter les différences importantes par rapport aux souris pour les rats qui existent dans les techniques générales. Pour le système de classification d'âge embryonnaire, E1 est classé comme le jour de la fiche pour l…

Representative Results

La collection CSF devrait produire un liquide clair, transparent. Il devrait y avoir aucune preuve de contamination par le sang, comme l'a démontré par un fluide teinté de rouge ou jaune dans l'aspiration et dans le tube Eppendorf. Il devrait également y avoir aucun signe de tissu dans l'aspiration et le tube Eppendorf. Lorsque le LCR est centrifugé, on peut aussi évaluer la LCR au microscope pour s'assurer qu'il n'ya pas de contamination. S'il ya des signes de contamination, le CSF doi…

Discussion

La méthode décrite pour la collecte ventriculaire CSF a abouti à des échantillons relativement purs des embryonnaire CSF avec la composition protéique stable et cohérente dans l'activité d'un certain nombre de tests cellulaires ^9. Avec une technique de collecte et de bonne taille de la portée de dix souris E14.5, on peut s'attendre à recueillir 10-15 ul de LCR, et d'une portée de rats E16, on peut s'attendre à recueillir environ 50-90 ul de LCR. Cette technique de collecte de mi…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Wiretrop II capillary needles	Drummond Scientific	#5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	#184 SIL ELAST kit
Aspirator tube assembly	Sigma	#A5177-5EA
Disposable filter	Venturi or local pharmacy	not available	Standard cigarette filter
Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife)	World Precision Instruments, Inc.	#500250
35mm glass bottomed culture dish	MatTek Corp.	#P35G-1.5-14-C
Platinum-iridium wire	Tritech Research	#PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane	Whatman	#09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution	Fisher Scientific	#SH30031.FS
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	#15000-02