Isolering av cerebrospinalvätska från Gnagare Embryon för användning med Dissekerade cerebrala kortikala Explantat
Summary
Den ventrikulära cerebrospinalvätskan (CSF) badar neuroepiteliala och cerebral kortikala progenitorceller under hjärnans tidiga utveckling i embryot. Här beskriver vi den metod som utvecklats för att isolera ventrikulär CSF från gnagare embryon i olika åldrar för att undersöka dess biologiska funktion. Dessutom visar vi vår cerebral kortikal explantat dissektion och kultur teknik som möjliggör explantat tillväxt med minimala volymer odlingsmedium eller cerebrospinalvätska.
Abstract
CSF är en komplex vätska med ett dynamiskt varierande proteom hela utveckling och i vuxen ålder. Under fosterutvecklingen, skiljer den begynnande CSF från fostervattnet vid stängning av den främre neuralröret. Cerebrospinalvätskan ökar sedan över följande dagar som neuroepiteliala stamceller kantar ventriklar och koroidea plexus generera CSF. De embryonala CSF kontaktar apikala, ventrikulär yta av neurala stamceller i utvecklingsländerna hjärnan och ryggmärgen. CSF ger avgörande vätsketryck för utbyggnad av den växande hjärnan och distribuerar viktiga tillväxtbefrämjande faktorer till neurala stamceller i en tidsmässigt-specifikt sätt. För att undersöka funktionen av CSF, är det viktigt att isolera rena prover av embryonala CSF utan kontaminering från blod eller utvecklingsländerna telencephalic vävnaden. Här beskriver vi en teknik för att isolera relativt rena prover av ventrikulär embryonal CSF som kan användas förett brett spektrum av experimentella tester inkluderande masspektrometri, protein-elektrofores, och cell-och primär explantat kultur. Vi visar hur att dissekera och kultur kortikala explantat på porösa polykarbonatmembran för att växa utveckla kortikal vävnad med minskade volymer av media eller CSF. Med denna metod, kan experiment utföras med användning av CSF från olika åldrar eller villkor för att undersöka den biologiska aktiviteten av CSF proteomet på målceller.
Introduction
CSF är en komplex vätska som badar utvecklingsländerna neuroepitelet 1-6 och ger grundläggande tryck 7 och tillväxtbefrämjande ledtrådar för den växande hjärnan 8-12. För att studera GSR under loppet av hjärnans utveckling, har vi utvecklat tekniker för att isolera ventrikulär CSF från att utveckla råtta eller mus embryon under olika stadier av utveckling 6,9. Tidigare metoder för isolering ingår med ett glas mikro-nål och isolera GSR med en mikro-injektor 1,2. Vår metod använder en glas mikro-kapillärpipett vars spets har dragits för att skapa en ultrafin punkt för förbättrad vävnadspenetrering. Glaset mikro-kapillärpipett är ansluten till en sug så att ventrikulär CSF samling kan styras med mjuka förändringar i trycket. För att undersöka påverkan stamceller av CSF-signaler, dissekera vi cerebrala kortikala explantat, placera dem på polykarbonatmembran och flyta dem på lämpliga culture medium kompletterat med CSF-prov 9. Med denna teknik, minskade volymer av media är tillräckliga för att kulturen vävnaden, vilket möjliggör en effektiv användning av CSF 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna metoden för ventrikulär CSF insamling har gett relativt rena prover av embryonala CSF med stabil proteinkomposition och konsekvent aktivitet i ett antal cellulära analyser 9. Med en bra samling teknik och kullstorlek på tio E14.5 möss, kan man förvänta sig att samla 10-15 il CSF och från en kull på E16 råttor kan man förvänta att samla cirka 50-90 il CSF. Denna samling teknik minimerar kontaminering från blod och vävnad, genom noggrann observation, centrifugering och kassering av p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för stöd från NIH (Award nummer R00 NS072192 till MKL, HD029178 till AS.L. och 2 RO1 NS032457 till CAW). MKL är mottagaren av barnsjukhuset Boston Karriärutveckling Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship och en kamrat av Alfred P. Sloan Foundation. CAW är en utredare för Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Biologie du développement. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Biologie du développement. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Biologie du développement. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
