Ontwikkeling, uitbreiding en<em> In vivo</em> Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)
Summary
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling, groei en in vivo beeldvorming van NK cellen uit hESCs en iPSCs.
Abstract
We stellen een werkwijze voor het afleiden van natuurlijke killer (NK) cellen ongedifferentieerd hESCs en iPSCs met een feeder-free benadering. Deze methode leidt tot hoge niveaus van NK-cellen na 4 weken kweek en verder log2 uitbreiding met kunstmatige antigeenpresenterende cellen ondergaan. hESC-en IPSC-afgeleide NK-cellen ontwikkeld in dit systeem hebben een volwassen fenotype en functie. De productie van grote hoeveelheden van genetisch beïnvloedbare NK-cellen kan zowel voor de mechanistische basis als anti-tumor studies. Expressie van vuurvliegluciferase in hESC-afgeleide NK-cellen kan een niet-invasieve benadering van NK cellen aanslaan, distributie, en de functie volgt. We hebben ook een dual-imaging regeling die het mogelijk maakt afzonderlijke bewaking van twee verschillende celpopulaties hun interacties duidelijker karakteriseren in vivo te beschrijven. Deze methode van afleiding, expansie, en dual in vivo beeldvorming biedt een betrouwbare aanpak voor de productie van NK-cellen en hun evaluatieatie die nodig zijn om de huidige NK cel adoptie therapieën te verbeteren is.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn ongedifferentieerde, pluripotente cellen die in staat onbeperkt zelf-vernieuwing en multi-lijn differentiatie. hESCs zijn succesvol onderscheiden in volwassen en functionele subsets van iedere kiem lagen, waaronder cellen van het hematopoietische systeem 1-3. Natural killer (NK) cellen zijn lymfocyten van het aangeboren immuunsysteem, dat kan worden afgeleid uit hESCs door de vorming van embryoid instanties (EBS) 4,5 of co-cultuur met stromale cellijnen 1,2,6-8. NK-cellen bezitten anti-virale en anti-tumor vermogens en hebben het potentieel om effectief te zijn tegen een breed spectrum van tumoren, omdat zij niet gevalideerd antigeenstimulatie hun effectorfuncties uitvoeren. Aldus hESC-afgeleide NK cellen een aantrekkelijke bron van cellen voor immunotherapie. Daarnaast is de afleiding van NK-cellen uit hESCs biedt een genetisch vatbaar systeem om normale ontwikkeling studeren <em> in vitro.
Omdat zij een genetisch handelbaar systeem kan hESC-afgeleide cellen NK experimenteel aangepast om fluorescente en bioluminescente reporters drukken waardoor een optimale model NK cell effector functie in vitro en in vivo. hESC-afgeleide NK-cellen bezitten activiteit tegen een aantal doelen, waaronder HIV 9, leukemie (K562) en andere vormen van kanker 7,8. De mogelijkheid om efficiënt genoeg leiden NK cellen die in staat om patiënten blijft een belangrijke hinderpaal voor klinische toepassing en, in mindere mate, een beperking voor uitgebreide preklinische in vivo studies van NK cel ontwikkeling en anti-kanker functies. Hier gebruiken we een spin EB benadering van hematopoietische voorlopercellen ontlenen hESCs 4,5,10. Na 11 dagen de spin EBS worden overgebracht naar NK celkweek met of zonder feeders voor 28 dagen. Na 4 weken in NK cel kweekmedium, NK-cellen zijn transferred aan co-kweek met K562 cellen gemodificeerd om expressie membraangebonden interleukine 21 (IL-21), die als kunstmatige antigeenpresenterende cellen (aAPCs). Aanpassen van een protocol voor de uitbreiding van perifere bloed NK-cellen met behulp van deze kunstmatige APC's 11,12, zijn we in staat om NK-cellen uit te breiden 2-logs met behoud van een rijp fenotype en cytotoxische capaciteiten.
Dit proces van ontwikkeling en uitbreiding voldoende hESC-afgeleide cellen NK voor uitgebreide in vivo karakterisering. Voor in vivo studies, zijn we in staat om niet-invasief bewaken lange termijn innesteling en kinetiek van geïnjecteerde vuurvliegluciferase uiten (Fluc +), hESC-afgeleide NK-cellen met behulp van bioluminescentie beeldvorming. Bovendien zijn wij in staat om NK-cel interacties te volgen met tumorcellen met een dual, bioluminescente of fluorescerende beeldvorming regeling. Een eerdere studie van onze groep gebruikt bioluminescentie beeldvorming in een anti-tumor model om tumorprogressie en cle volgenarance van Fluc + K562-cellen in vivo 7. Nu, door de engineering van onze hESCs aan uitdrukkelijke vuurvliegluciferase 13,14 wij kunnen de biologische verdeling van en handel in NK-cellen te volgen naar K562 tumorcellen dat de onlangs gekenmerkt fluorescerend eiwit, turboFP650 15 drukken. We hebben dit dubbele reporter systeem gekozen om gelijktijdig volgen twee celpopulaties in vivo (figuur 1). De meeste dual imaging modellen zijn dual-luciferase systemen geweest, maar deze systemen kunnen technisch gezien een uitdaging vanwege de levering eisen van coelenterazine, de ondergrond die nodig zijn voor de expressie van de meeste Renilla en Gaussia luciferase reporters 16-18. Fluorescerende reporters hebben toegestaan eenvoudige controle van veel cellijnen en constructies in vitro, maar heeft beperkt succes voor in vivo beeldvorming moest vanwege de overlap tussen weefsel en bont autofluorescentie en de emissie spectra van vele commonly gebruikte fluorescerende verslaggevers waaronder GFP, DsRed en tdTomato 15,19. Deze bezorgdheid heeft de ontwikkeling van ver-fluorescerende eiwitten, waardoor betere weefsel penetrantie en hoger specifiek signaal vergeleken background 15,19 aangemoedigd. TurboFP650, het fluorescerende eiwit getoond in dit systeem, is ver-rood verschoven en overwint veel van de kwesties die met beeldvorming fluorescerende eiwitten in levende dieren.
Deze werkwijze voor het ontwikkelen en uitbreiden van NK cellen uit hESCs konden wij verder te karakteriseren hESC-afgeleide NK cellen in vitro en in vivo, waarbij een beter begrip nodig NK celfunctie en klinisch belang huidige NK cel adoptieve therapie verbeteren is. Het is ook ontvankelijk voor de afleiding en uitbreiding van iPSC-afgeleide NK cellen. De dubbele TL-en bioluminescentie beeldvorming regeling is breed toepasbaar op andere dan de anti-tumor model dat we hebben hier getoonde systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs zijn een ideaal platform om verschillende celtypes te bestuderen en te houden opmerkelijke potentieel voor klinische vertaling. We maken gebruik van een gedefinieerde, draai EB benadering van hESC / iPSCs differentiëren naar hematopoietische stamcellen. De spin EB aanpak consistente afleiding van hematopoietische stamcellen en differentiatie naar NK-cellen opgeleverd, maar toch, variatie bestaat nog steeds in differentiatie efficiëntie in cellijnen en moet mogelijk worden aangepast voor het genereren van andere …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Melinda Hexum bedanken voor aanvang van de spin EB-protocol binnen ons lab. We zouden graag bedanken voor andere leden van het lab, waaronder Laura E. Bendzick, Michael Lepley en Zhenya Ni voor hun technische ondersteuning bij dit werk. De auteurs willen ook Brad Taylor danken aan de Beugel Life Sciences voor zijn deskundig technisch advies.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
- Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
- Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
- Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
- Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
- Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
- Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
- Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
- Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
- Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
- Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
- Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
- Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).
