Sviluppo, di espansione, e<em> In vivo</em> Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)
Summary
Questo protocollo descrive lo sviluppo, l'espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.
Abstract
Vi presentiamo un metodo per derivare killer (NK) naturali da hESC indifferenziato e iPSCs utilizzando un approccio alimentatore-Free. Questo metodo comporta elevati livelli di NK dopo 4 settimane coltura e può subire un'ulteriore espansione 2-log con cellule presentanti l'antigene artificiali. hESC-e IPSC-derivato cellule NK sviluppati in questo sistema hanno un fenotipo e funzione maturo. La produzione di un gran numero di organismi geneticamente modificabili cellule NK è applicabile sia per meccanicistico di base così come gli studi anti-tumorali. Espressione di lucciola luciferasi in hESC-derivate cellule NK permette un approccio non invasivo per seguire l'attecchimento delle cellule NK, la distribuzione e la funzione. Abbiamo anche descrivono un sistema dual-imaging che consente il controllo separato di due diverse popolazioni cellulari di caratterizzare più nettamente le loro interazioni in vivo. Questo metodo di derivazione, espansione, e dual imaging in vivo fornisce un metodo affidabile per la produzione di cellule NK e loro valuzione che è necessario per migliorare attuali terapie adottive cellule NK.
Introduction
Cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), sono cellule pluripotenti indifferenziate capaci di auto-rinnovamento e multi-lignaggio differenziazione illimitata. hESCs sono stati differenziati successo in sottoinsiemi maturi e funzionali di ogni strato di germe, comprese le cellule del sistema ematopoietico 1-3. Killer (NK) naturali sono linfociti del sistema immunitario innato, che può essere derivato da cellule staminali embrionali umane per la formazione di corpi embrionali (EBS) 4,5 o co-coltura con linee di cellule stromali 1,2,6-8. Cellule NK possedere capacità anti-virali e anti-tumorale e hanno il potenziale di essere efficace contro una vasta gamma di tumori maligni, in quanto non richiedono stimolazione antigenica prima a svolgere le loro funzioni effettrici. Così, le cellule hESC-derivato NK sono un'interessante fonte di cellule per l'immunoterapia. Ulteriormente, la derivazione di cellule NK da hESCs fornisce un sistema geneticamente suscettibili di studiare lo sviluppo normale <em> in vitro.
Perché forniscono un sistema geneticamente trattabili, cellule hESC-derivato NK possono essere sperimentalmente modificate per esprimere reporter fluorescenti e bioluminescenti fornendo un modello ottimale per studiare NK funzioni effettrici cellulari in vitro e in vivo. cellule NK hESC-derivati possiedono attività contro una serie di obiettivi tra cui l'HIV 9, leucemia (K562) e altri tipi di cancro 7,8. Tuttavia, la capacità di ricavare in modo efficiente le cellule NK abbastanza capaci di curare i pazienti rimane un ostacolo importante per la traduzione clinica ed è, in misura minore, di una limitazione per la vasta pre-clinica in vivo dello sviluppo delle cellule NK e le funzioni anti-tumorali. Qui, usiamo un approccio EB selezione per derivare progenitori emopoietici dal hESCs 4,5,10. Following 11 giorni l'centrifuga EBs vengono trasferiti in coltura cellule NK con o senza alimentatori per 28 giorni. Dopo 4 settimane in coltura cellulare NK, cellule NK sono tran, trasferita a co-coltura con cellule K562 modificate per esprimere di membrana interleuchina 21 (IL-21), che servono come cellule presentanti l'antigene (aAPCs artificiali). Adattare un protocollo per l'espansione delle cellule NK nel sangue periferico utilizzando queste artificiale APCs 11,12, siamo in grado di espandere le cellule NK 2-log, pur mantenendo un fenotipo maturo e capacità citotossiche.
Questo processo di sviluppo e di espansione fornisce sufficienti cellule hESC-derivato NK vasta caratterizzazione in vivo. Per gli studi in vivo, siamo in grado di monitorare in modo non invasivo l'attecchimento a lungo termine e la cinetica di iniezione lucciola luciferasi che esprimono (Fluc +), le cellule NK hESC-derivate che utilizzano l'imaging bioluminescenza. Inoltre, siamo in grado di seguire le interazioni delle cellule NK con le cellule tumorali utilizzando uno schema di imaging doppio, bioluminescente o fluorescenti. Uno studio precedente dal nostro gruppo ha utilizzato l'imaging bioluminescenza in un modello anti-tumorale di seguire la progressione del tumore e CLEarance di Fluc + K562 in vivo 7. Ora, da Engineering nostri hESCs per esprimere lucciola luciferasi 13,14 siamo in grado di seguire la distribuzione biologica ed il traffico delle cellule NK per K562 cellule tumorali che esprimono la proteina fluorescente recentemente caratterizzata, turboFP650 15. Abbiamo scelto questo sistema duale giornalista per seguire simultaneamente le due popolazioni cellulari in vivo (Figura 1). La maggior parte dei modelli duali di imaging sono stati i sistemi dual-luciferasi, ma questi sistemi possono essere tecnicamente impegnativo a causa dei requisiti di consegna dei coelenterazine, il substrato necessario per l'espressione del più Renilla e Gaussia reporter luciferasi 16-18. Reporter fluorescenti hanno permesso un facile monitoraggio di molte linee cellulari e costrutti in vitro, ma ha avuto un successo limitato per imaging in vivo a causa della sovrapposizione tra il tessuto e autofluorescenza pelliccia e gli spettri di molti co emissionimmonly usato reporter fluorescenti tra GFP, DsRed e tdTomato 15,19. Questa preoccupazione ha favorito lo sviluppo di proteine fluorescenti far-rossi, che consentono una migliore penetranza del tessuto e del segnale specifico superiore rispetto al fondo 15,19. TurboFP650, la proteina fluorescente mostrato in questo sistema, è lontano-rosso spostato e supera molti dei problemi connessi con proteine fluorescenti di imaging in animali viventi.
Questo metodo per sviluppare ed espandere cellule NK derivate da hESCs ha permesso di caratterizzare ulteriormente hESC-derivato cellule NK in vitro e in vivo, che è necessario per comprendere meglio la funzione delle cellule NK e clinicamente importante migliorare attuali terapie adottive cellule NK. È anche suscettibile di derivazione e l'espansione delle cellule NK iPSC-derivati. Il sistema di imaging a fluorescenza e bioluminescenti duale è ampiamente applicabile a sistemi diversi dal modello anti-tumorale abbiamo mostrato qui.
Protocol
Representative Results
Discussion
hESCs sono una piattaforma ideale per studiare diversi tipi di cellule e mantenere un notevole potenziale per la traduzione clinica. Usiamo un, giro approccio EB definito per differenziare hESC / iPSCs di cellule progenitrici ematopoietiche. L'approccio EB giro ha dato derivazione consistente di cellule progenitrici ematopoietiche e la differenziazione di cellule NK, ma, variazione esiste ancora in efficienza differenziazione tra linee di cellule e può avere bisogno di essere modificati per la generazione di altre …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Melinda Hexum per l'inizio del protocollo EB rotazione all'interno del nostro laboratorio. Vorremmo ringraziare gli altri membri del laboratorio, tra cui Laura E. Bendzick, Michael Lepley, e Zhenya Ni per la loro assistenza tecnica con questo lavoro. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Brad Taylor al Caliper Life Sciences per la sua consulenza tecnica di esperti.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Media | |||
| BPEL media for Spin EB generation | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Fisher Scientific | SH3022801 | |
| F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I | Invitrogen | 31765035 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3311 | Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity. |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L2376 | |
| Synthechol 500X solution | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| a-monothioglycerol (a-MTG) | Sigma-Aldrich | S5442 | |
| Protein-free hybridoma mix II | Invitrogen | 12040077 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax I | Invitrogen | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| NK Differentiation Media | |||
| Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-118 | |
| F-12 Media | Invitrogen | CX30315 | |
| 15% Human AB serum | Valley Biomed | HP1022HI | |
| 5 ng/ml Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| 50 uM ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| 20 ng/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 25 uM 2-mercaptoethanol (BME) | Gibco | 21985 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | CX30310 | |
| 1% Pen-Strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Cytokines | |||
| (all cytokines used fresh from frozen aliquots) | |||
| SCF | PeproTech, Inc. | 300-07 | 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot. |
| rhBMP-4 | R &D Systems | 314-BP | 20 ng/ml in BPEL media |
| rhVEGF | R&D Systems | 293-VE | 20 ng/ml in BPEL media |
| IL-2 | PeproTech, Inc. | 200-02 | 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol |
| IL-15 | PeproTech, Inc. | 200-15 | 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only) |
| IL-3 | PeproTech, Inc. | 200-03 | 5 ng/ml in NK media |
| IL-7 | PeproTech, Inc. | 200-07 | 20 ng/ml in NK media |
| Flt-3-Ligand | PeproTech, Inc. | 300-19 | 10 ng/ml in NK media |
| In vivo Imaging | |||
| D-Luciferin Sodium Salt | Gold BioTechnology | Lucna-500 | |
| TurboFP650 plasmid | Evrogen, Moscow, Russia | FP731 | Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab. |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Cells | |||
| Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells | MD Anderson, Houston, TX | contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood | |
| Firefly luciferase expressing hESCs | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5′ end of a GFP:zeocin fusion construct. | |
| TurboFP650 expressing K562 cells | University of Minnesota, Minneapolis, MN | contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section |
Materials Table.
References
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