Une technique simple et fiable pour la visualisation et quantification des voies respiratoires motilité des cils et cils de flux générés en utilisant la souris trachée est décrite. Cette technique peut être modifiée pour déterminer comment un grand nombre de facteurs influencent la motilité des cils, y compris les agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus.
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Article de méthode
Ex méthode in vivo pour l'imagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une technique ex vivo pour l'imagerie souris épithélium des voies respiratoires pour l'analyse quantitative de la fonction de cils mobiles importante pour comprendre la fonction de la clairance mucociliaire a été établi. Fraîchement récoltées souris trachée est coupé longitudinalement à travers le muscle trachéal et monté dans une chambre fortifiée peu profonde sur un plat à fond de verre. L'échantillon trachée est positionné le long de son axe pour tirer profit du muscle trachéal à se recourber longitudinalement. Cela permet à l'imagerie du mouvement ciliaire dans la vue de profil sur toute la longueur trachéale. Vidéos à 200 images / sec sont obtenus en utilisant l'interférence différentiel microscopie en contraste et une caméra numérique à haute vitesse pour permettre une analyse quantitative de la fréquence de battement des cils et forme d'onde ciliaire. Avec l'ajout de billes fluorescentes lors de l'imagerie, les cils écoulement de fluide générée peut également être déterminé. Le temps de protocole couvre environ 30 min, à 5 min de préparation chambre, 5-10 min pour l'échantillonmontage et 10-15 min pour vidéomicroscopie.
Introduction
Analyse de la fonction de cils mobiles dans l'épithélium des voies respiratoires est expérimentalement importantes pour comprendre les facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent affecter la clairance muco-ciliaire et la santé pulmonaire 1. Le protocole simple mis au point pour l'imagerie de la souris épithélium des voies respiratoires constitue une méthode efficace pour interroger voies cils motilité des modèles mutants et KO souris et ne nécessitent que des compétences de base chez la souris dissection du tissu trachéal et l'imagerie ex vivo des voies respiratoires cils motilité avec vidéo-microscopie à haute résolution. Ce p....
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Protocole
1. Réactifs Setup
1.1 Dissection et l'imagerie moyen
L-15 du milieu de Leibovitz (L15) est complété avec du FBS (10%) et pénicilline-streptomycine (100 unités / ml de pénicilline G sodique et 100 pg / ml de sulfate de streptomycine) est utilisé à la fois pendant la récolte et de l'imagerie d'échantillons trachée.
2. Shallow fortifiée hémicycle de la culture
La chambre utilisée pour maintenir le tissu trachée est illustré à la figure 1. Le sol de la chambre est le fond de verre 35 mm boîte de culture. Le haut et le côté de la chambr....
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Résultats
Contrôle des voies aériennes cils doit être clairement visible et vu à battre de manière coordonnée (Film 1 supplémentaire; la lecture du film est ralentie à 15% en temps réel), avec un débit notable dans le sens du battement de cils (Film complémentaire 2; la lecture du film est de 100% temps réel). La quantification des films de cils devrait donner des résultats similaires à ceux observés dans la figure 3. Collection de films DIC à grande vitesse permet la quantificat.......
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Discussion
Mesure de la fréquence de battement des cils (CBF) est relativement facile en utilisant objectifs de microscope haute puissance et l'image matériel d'acquisition rapide 13,15, et explique pourquoi les mesures CBF forment la base de la plupart des études portant sur la clairance mucociliaire pendant la santé et la maladie. Cependant, alors que la mesure CBF est essentielle pour comprendre clairance muco-ciliaire, la mesure de CBF seul ignore l'importance fondamentale des deux flux générés ciliair.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Le projet a été soutenu par le NIH subvention U01HL098180 du National Heart, Lung, and Blood Institute. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Heart, Lung, and Blood Institute ou le National Institutes of Health
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Leibovitz' s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | Sans phénol rouge |
| Sérum fœtal bovin | Hyclone | SH30088.03 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x pince fine | Roboz | RS-4976 | |
| Ciseaux de dissection | Roboz | RS-5676 | |
| Ciseaux de micro-dissection | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| pointes P1000 | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm rond en verre Couvercles | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastique 35 mm Boîtes de culture | Corning | 430588 | |
| Fond en verre 35 mm Boîtes de culture | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Feuille de silicone 0,012" (0,3 mm) d’épaisseur | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0,20 &mu ; m de diamètre Fluoresbrite YG Carboxylate Microsphères Polysciences | 09834-10 | ||
| Microscope inversé, avec objectif à huile 100x et filtres DIC | La marque Lecia | DMIRE2 | n’est pas critique. |
| Lampe au mercure de 100 watts, filtres d’excitation/émission FITC épifluorescents | Lecia n’est | pas critique. | |
| Platine de microscope Incubateur | Lecia | 11521749 | Non requis si l’imagerie des cils à température ambiante |
| Caméra haute vitesse à champ lumineux | Vision Research | Phantom v4.2 | La marque n’est pas critique. Doit être plus rapide que 125 fps |
| Caméra fluorescente à grande vitesse | Hamamatsu | C9100-12 | La marque n’est pas critique. Doit être plus rapide que 10 fps |
| Logiciel d’analyse de films | National Institutes of Health | ImageJ avec plugin |
Références
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in....
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Réimpressions et autorisations
