在啮齿类动物呼吸道上皮纤毛运动功能的高分辨率成像的体外方法
Summary
一个简单而可靠的可视化和量化技术，气道纤毛的蠕动和纤毛产生流量使用小鼠气管。这种技术可以被修改，以确定如何广泛的因素，包括药物制剂，遗传因素，环境暴露，和/或机械因素，如粘液负载影响纤毛运动。
Abstract
体外小鼠气道上皮细胞成像技术定量分析洞察黏液纤毛清除功能的重要运动纤毛功能已经确立。刚收获的小鼠气管，通过纵向切开气管肌肉和安装在浅壁室玻璃底的菜。其长轴沿气管样品趁气管肌肉纵向卷曲。这使得成像的纤毛运动，沿着整个气管长度在纵断面图。使用微分干涉显微镜和一个高速的数码相机得到允许纤毛摆动频率的定量分析和睫状波形画在200帧/秒。在成像过程中添加的荧光珠，纤毛产生的流体流动也可以被确定。协议时间跨越约30分钟，5分钟5-10分钟的样品制备室安装，和10-15分钟电视显微镜。
Introduction
阐明遗传和环境因素会影响粘液纤毛清除功能和肺的健康1，气道上皮细胞的运动纤毛功能分析实验是重要的。成像的小鼠气道上皮细胞的简单的协议，开发提供了一种有效的方法来审问呼吸道纤毛运动的突变体和基因敲除小鼠模型，并在小鼠气管组织解剖和体外成像与高清晰度电视显微镜，呼吸道纤毛蠕动只需要基本技能。此协议在建立和完善了大规模的鼠标诱变屏幕，运动纤毛功能允许快速评估（纤毛摆动频率，纤毛摆动形状，纤毛产生的流量）患有先天性心脏疾病的伴有内脏异位2-5的突变体。
目前的技 术，用于研究呼吸道纤毛蠕动，可以分组为急性体外类型或离子蒙古包长期在体外实验方法。急性实验包括人/鼻气道活检刷6,7 体外可视化和分析简单的横向气道第8。 在体外细胞培养方法利用各种技术，以产生分化的纤毛上皮细胞，如空气中的液体界面的文化或气悬浮培养9-11张。然而，这些气道上皮reciliation的技术要求非常显著的投资在时间和培训之前任何可用的纤毛上皮细胞的实验（4-6周9,10）。虽然通常用于人体临床研究急性呼吸道上皮刷活检体外分析，这种方法是不是可以使用小鼠的研究，由于加剧了机械组织损伤12。
在这个协议中所述的技术分析的谅解备忘录ê气管的气道上皮细胞不仅是简单的执行，但它不需要特殊的解剖技能，也没有任何专门的设备除了那些电视显微镜成像标准。这个简单的协议有许多优点。首先，小鼠气管组织收获是快速和容易执行，它允许大量的小鼠气道纤毛功能快速评估。这可以包括急性分析不同在体外治疗的短期效果。其次，作为体外技术，气道纤毛上皮细胞仍然连接到相关的支持组织和，从而保留相关的细胞信号通路。因此，在比较， 在体外 reciliated的气道上皮细胞，该制剂在体内的组织环境是一个更好的代表性的自然。第三，该协议允许收购了一些不同的量化参数，可以提供客观的评估运动纤毛f油膏。最后，在对比其他流动呼吸道纤毛可视化的方法，这个协议允许的纤毛纤毛摆动方向直角可视化，允许纵断面图中的纤毛，是最佳的高分辨率成像的纤毛摆动和metachronal的波代。
这个协议可以修改了一些方法来解决了广泛的实验需求等作用的药物制剂，遗传因素，环境暴露，和/或机械因素，如粘液负载上呼吸道纤毛功能和生成/维护呼吸道纤毛摆动和波传播metachronal。
Protocol
Representative Results
Discussion
测量纤毛摆动频率（CBF）是比较容易的使用高倍显微镜的目标和快速的图像采集硬件13,15，并解释了为什么脑血流量测量形成的基础研究在健康和疾病中的黏液纤毛清除。然而，当脑血流量测量是必不可少的了解黏液纤毛清除，单独测量CBF睫状肌产生的流量和纤毛摆动波形，这两者都是比较难以衡量，往往被忽视的重要性，忽略了潜在的，可能没有相关的脑血流量。例如如何增加脑血流量…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目是由NIH授予U01HL098180从支持国家心脏，肺和血液研究所。内容完全是作者的责任，并不一定代表官方意见，国家心脏，肺和血液研究所或国立卫生研究院
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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