Ex vivo metode for High Resolution Imaging av Cilia Motility i Gnagere Airway epithelia
Summary
En enkel og pålitelig teknikk for å visualisere og kvantifisere luftveier flimmerhårene motilitet og flimmerhårene generert strøm ved hjelp av musen luftrøret er beskrevet. Denne teknikk kan endres for å bestemme hvordan en rekke faktorer påvirker cilia motilitet, inkludert farmakologiske midler, genetiske faktorer, miljømessige eksponeringer, og / eller mekaniske faktorer som slim belastning.
Abstract
En ex vivo teknikk for bildebehandling mus luftveier epitel for kvantitativ analyse av bevegelige flimmerhårene funksjon viktig for innsikt i mucociliary mucocilliære er etablert. Nyhøstet mus luftrøret kuttes i lengderetningen gjennom trachealis muskel og montert i et grunt vegger kammer på en glass-bunn parabolen. Luftrøret prøven er plassert langs den lange aksen å dra nytte av den trachealis muskler til å krølle lengderetningen. Dette tillater avbildning av ciliary bevegelse i profil langs hele tracheal lengde. Videoer på 200 bilder / sek er innhentet ved hjelp av differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi og en høyhastighets digitalt kamera til å tillate kvantitativ analyse av flimmerhårene slo frekvensen og ciliary bølgeform. Med tillegg av fluoriserende perler under avbildning, cilia generert fluidstrøm også kan bestemmes. Protokollen tid spenner over ca 30 min, med 5 min for kammeret forberedelse, 5-10 min for prøvenmontering, og 10-15 min for videomicroscopy.
Introduction
Analyse av bevegelige flimmerhårene funksjon i luftveiene epitel er eksperimentelt viktig for å belyse de genetiske og miljømessige faktorer som kan påvirke mucociliary klarering og oksygenopptak en. Den enkle protokoll utviklet for bildebehandling musen luftveier epitel gir en effektiv metode for å avhøre luftveier flimmerhårene motilitet i mutant og knockout musemodeller og krever bare grunnleggende ferdigheter i musen tracheal vev disseksjon og eks vivo avbildning av luftveiene flimmerhårene motilitet med høy oppløsning videomicroscopy. Denne protokollen ble etablert og videreutviklet under en storstilt mus mutagenese skjermen for å tillate rask evaluering av bevegelige flimmerhårene funksjon (flimmerhårene slo frekvensen, flimmerhårene slo form, flimmerhårene generert flow) på mutanter med medfødt hjertesykdom assosiert med heterotaxy 2-5.
Dagens teknikker brukes til å studere luftveier flimmerhårene motilitet kan grupperes i enten akutt ex vivo type eller longer term in vitro eksperimentelle tilnærminger. Akutte eksperimenter inkluderer ex vivo visualisering av menneskelige nese / luftveier børste biopsier 6,7 og analyse av enkle tverrgående luftveier § § 8. De i vitro tilnærminger utnytte ulike cellekultur teknikker for å generere ark med differensierte ciliated epithelia eksempel i luft flytende grensesnitt kulturene eller luftveier suspensjon kulturer 9-11. Men disse luftveier epitel reciliation teknikker krever meget betydelig investering i tid og opplæring før noen brukbare ciliated epitelceller er produsert for eksperimentering (4-6 uker 9,10). Mens akutt ex vivo analyse av luftveiene epiteliale pensel biopsier blir ofte brukt for kliniske studier, er denne metoden ikke brukbare i mus studier på grunn av forsterket mekanisk vevskade 12.
Teknikken er beskrevet i denne protokoll for analyse av mouse tracheal luftveier epitel er ikke bare enkelt å utføre, men det krever ingen spesielle disseksjon ferdigheter eller noen spesialisert utstyr foruten de standard for avbildning av videomicroscopy. Det er mange fordeler med denne enkle protokollen. Først, som mus luftrøret vev innhøsting er rask og enkel å utføre, gir det mulighet for rask vurdering av luftveiene cilia funksjon i et stort antall mus. Dette kan omfatte akutt analyse av de kortsiktige effektene av forskjellige in vitro-behandlinger. Sekund, som er en ex vivo teknikk, forblir ciliated luftveier epitel knyttet til den underliggende støtte vev og dermed beholde forbundet celle signalveier. Derfor i forhold til in vitro reciliated luftvei epitel er preparatet en bedre representasjon av det naturlige in vivo vev miljø. Tredje, gjør denne protokollen oppkjøp av en rekke ulike kvantitative parametre som kan gi objektiv vurdering av bevegelige flimmerhårene fsalvelse. Til slutt, i motsetning til andre aktuelle metoder for luftveiene cilia visualisering, tillater denne protokoll for visualisering av cilia i rett vinkel til den cilia takten retning, slik at profilen visning av cilia som er optimal for høy oppløsning av cilia beat og metachronal bølge generering .
Denne protokollen kan endres på en rekke måter å løse et bredt spekter av eksperimentelle behov som rollen som farmakologiske midler, genetiske faktorer, miljømessige eksponeringer, og / eller mekaniske faktorer som slim belastning på luftveiene flimmerhårene funksjon og produksjon / vedlikehold av luftveier flimmerhårene beat og metachronal bølgeutbredelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Måling av flimmerhårene slo frekvensen (CBF) er relativt enkelt å bruke kraftige mikroskop mål og rask bildeoverføring maskinvare 13,15, og forklarer hvorfor CBF Målingene danner grunnlaget for de fleste studier som undersøker mucociliary klaring under helse og sykdom. Men mens CBF målingen er avgjørende for forståelsen av mukociliær renselse, måling av CBF alene ignorerer den underliggende betydning både ciliare generert strømning og cilia takten bølgeform, som begge er mer vanskelig å måle,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prosjektet ble støttet av NIH stipend U01HL098180 fra National Heart, Lung, and Blood Institute. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer de offisielle visningene av National Heart, Lung, and Blood Institute eller National Institutes of Health
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O’Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
