Простой и надежный способ для визуализации и количественной дыхательных путей подвижность ресничек и реснички создан поток с помощью мыши трахеи описано. Этот способ может быть модифицирован, чтобы определить, как широкий спектр факторов, влияющих реснички подвижность, в том числе фармакологические агенты, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки.
Бывших естественных условиях технику для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей для количественного анализа подвижных функция ресничек важно для понимания функции мукоцилиарного клиренс был создан. Свежесобранных мыши трахею разрезают в продольном направлении через trachealis мышц и установлен в мелкой стенами палаты по стеклянным дном блюда. Образец трахеи, расположенных вдоль его продольной оси, чтобы воспользоваться trachealis мышц к скручиванию в продольном направлении. Это дает возможность получить изображение цилиарной движения в виде профиля по всей длине трахеи. Видео со скоростью 200 кадров / сек получены с использованием дифференциального интерференционного контрастной микроскопии и высокоскоростные цифровые камеры, чтобы позволить количественного анализа ресничек частота биений и цилиарного сигнала. С добавлением флуоресцентные шарики во время съемки, реснички генерируется поток жидкости также может быть определена. Протокол отрезки времени около 30 мин, всего 5 мин для приготовления камере, 5-10 мин для образцамонтаж, и 10-15 мин для видеомикроскопии.
Анализ функции подвижных ресничек эпителия дыхательных путей экспериментально важно для выяснения генетических и экологических факторов, которые могут повлиять мукоцилиарный клиренс и легочной здоровья 1. Простой протокол, разработанный для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей обеспечивает эффективный способ, чтобы допросить подвижность ресничек в дыхательных путях мутанта и нокаут модели мыши и требуются только базовые навыки в мышь рассечение тканей трахеи и бывших естественных изображений ресничками дыхательных путей с высокой подвижностью видеомикроскопии разрешение. Этот протокол был создан и уточняться в ходе крупномасштабной экрана мутагенеза мыши для обеспечения быстрой оценки функции подвижные реснички (частота реснички бить, бить форму реснички, реснички создан поток) у мутантов с врожденными пороками сердца, связанных с heterotaxy 2-5.
Современные методы используются для изучения подвижности ресничек дыхательных путей могут быть сгруппированы либо в естественных условиях острого типа бывших или LONGER термин в пробирке экспериментальных подходов. Острых опытах, последующую визуализации естественных носа человека / дыхательных путей биопсии кистью 6,7 и анализ простых поперечных срезов дыхательных путей 8. В пробирке подходы используют различные методы клеточной культуры для создания листов мерцательного эпителия дифференцированных например в воздухе жидких культур интерфейса или дыхательных путей суспензионных культур 9-11. Однако эти методы эпителия дыхательных путей reciliation требуют очень значительных затрат времени и подготовки, прежде чем какая-либо полезная мерцательного эпителия клетки производятся для экспериментов (4-6 недели 9,10). В то время как анализ естественных условиях острой Ех эпителия дыхательных путей биопсии кисти обычно используются для человека клинические исследования, этот метод не может использоваться в исследованиях на мышах усугубляется из-за механического повреждения тканей 12.
Техники, изложенные в настоящем Протоколе для анализа МОВэлектронной трахеи эпителия дыхательных путей не только простых для исполнения, но это не требует никаких специальных навыков вскрытия, ни специального оборудования, кроме тех, стандартных для работы с изображениями на видеомикроскопии. Есть много преимуществ для этого простой протокол. Во-первых, как ткани мыши трахеи урожай быстро и легко выполнить, оно позволяет для быстрой оценки функции ресничек дыхательных путей в большом количестве мышей. Это может включать острое анализ краткосрочных эффектов различных в пробирке лечения. Второй, будучи бывшим технику естественных условиях, мерцательного эпителия дыхательных путей остается прикрепленным к нему, лежащих в основе опорных тканей и, следовательно, вести соответствующие клеточных сигнальных путей. Поэтому по сравнению с в пробирке reciliated эпителия дыхательных путей, этот препарат является лучшим представлением естественной среды в ткани естественных условиях. В-третьих, этот протокол позволяет приобретение целого ряда различных количественных параметров, которые могут обеспечить объективную оценку подвижные реснички Fпомазание. Наконец, в отличие от других современных методов для визуализации ресничками дыхательных путей, этот протокол позволяет выводить реснички под прямым углом к направлению удара реснички, позволяющий вид профиля реснички, оптимальные для получения изображения с высоким разрешением реснички избили и метахрональная поколения волны .
Этот протокол может быть модифицирован различными способами для решения широкого круга экспериментальных потребностей, таких как роли фармакологических агентов, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки на функции дыхательных путей реснички и генерации / поддержание дыхательных путей бить ресничек и метахрональная распространения волны.
Измерение частота биений ресничек (CBF) относительно легко Использование мощных микроскопа цели и быстро аппаратного захвата изображений 13,15, и объясняет, почему CBF измерений основой Большинство исследований с целью мукоцилиарный клиренс во здоровья и болезни. Тем не менее, в то в?…
The authors have nothing to disclose.
Проект был поддержан грантом NIH U01HL098180 от Национального сердца, легких и крови институт. Материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального сердца, легких и крови институт или Национального института здоровья
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |