Método ex vivo de Imágenes de Alta Resolución de Motilidad Cilia en roedores las vías respiratorias epitelio
Summary
Se describe una técnica sencilla y fiable para la visualización y cuantificación de las vías respiratorias motilidad de los cilios y los cilios flujo generado a través del ratón tráquea. Esta técnica puede ser modificada para determinar cómo una amplia gama de factores que influyen en la motilidad de los cilios, incluyendo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco.
Abstract
Se ha establecido una técnica ex vivo para la imagen del ratón vías respiratorias epitelios para el análisis cuantitativo de la función de los cilios inmóviles importante para conocer a fondo la función mucociliar. Recién cosechada ratón tráquea se corta longitudinalmente a través del músculo traqueal y se monta en una cámara de paredes poco profundas en un plato con fondo de cristal. La muestra tráquea se coloca a lo largo de su eje largo para tomar ventaja del músculo traqueal a rizarse longitudinalmente. Esto permite formación de imágenes de movimiento ciliar en la vista de perfil a lo largo de toda la longitud traqueal. Videos en 200 cuadros / seg se obtienen utilizando microscopía de contraste diferencial de interferencia y una cámara digital de alta velocidad para permitir el análisis cuantitativo de la frecuencia de batido ciliar y la forma de onda ciliar. Con la adición de perlas fluorescentes durante la formación de imágenes, los cilios de flujo de fluido generada también se puede determinar. El tiempo de protocolo se extiende por aproximadamente 30 min, con 5 min para la preparación cámara, 5-10 min para la muestramontaje y 10-15 minutos para videomicroscopy.
Introduction
Análisis de la función de cilios móviles en la vía aérea epitelios experimentalmente es importante para dilucidar los factores genéticos y ambientales que pueden afectar a la salud y el aclaramiento mucociliar pulmonar 1. El simple protocolo desarrollado para la formación de imágenes con el ratón vías respiratorias epitelios proporciona un método eficiente para interrogar a las vías respiratorias en la motilidad de los cilios modelos mutantes y ratón knockout y requiere solamente habilidades básicas del ratón en la disección del tejido traqueal y la formación de imágenes ex vivo de las vías respiratorias con la motilidad de los cilios videomicroscopy alta resolución. Este protocolo fue creado y perfeccionado durante una pantalla de mutagénesis ratón a gran escala para permitir una rápida evaluación de la función de los cilios móviles (frecuencia de batido ciliar, la forma de batido ciliar, el flujo generado cilios) en los mutantes con cardiopatía congénita asociada a heterotaxy 2-5.
Las técnicas actuales utilizadas para estudiar las vías respiratorias cilios motilidad se pueden agrupar en ya sea el tipo ex vivo aguda o lonplazo ger en los enfoques experimentales in vitro. Experimentos agudos incluyen la visualización ex vivo de nasales / vías respiratorias humanas biopsias cepillo 6,7 y el análisis de las secciones transversales de las vías respiratorias simples 8. Los enfoques in vitro utilizan varias técnicas de cultivo celular para generar hojas de epitelio ciliado diferenciadas tales como en cultivos líquidos de interfaz de aire o cultivos en suspensión las vías respiratorias 9-11. Sin embargo, estas técnicas reciliation epitelios de las vías respiratorias requieren una inversión muy significativa en el tiempo y la formación antes de que las células epiteliales ciliadas utilizables se producen para la experimentación (4-6 semanas 9,10). Mientras que el análisis ex vivo aguda de las vías respiratorias epiteliales biopsias cepillo se utilizan comúnmente para los estudios clínicos humanos, este método no se puede utilizar en los estudios del ratón exacerbado debido a la lesión tisular mecánico 12.
La técnica descrita en este protocolo para el análisis de los memorandos de entendimientoe las vías respiratorias epitelio traqueal no sólo es sencillo de ejecutar, pero no requiere de habilidades especiales de disección ni cualquier equipo especializado además de los estándar para la formación de imágenes por videomicroscopía. Hay muchas ventajas de este protocolo simple. En primer lugar, como el ratón la cosecha de tejidos tráquea es rápida y fácil de realizar, que permite una evaluación rápida de la función de los cilios las vías respiratorias en un gran número de ratones. Esto puede incluir el análisis aguda de los efectos a corto plazo de diferentes tratamientos en in vitro. En segundo lugar, siendo una técnica ex vivo, el epitelio de las vías respiratorias ciliado permanece unido a él que subyace tejidos de soporte y por lo tanto retener vías de señalización celular asociadas. Por lo tanto, en comparación con las vías respiratorias in vitro reciliated epitelios, esta preparación es una mejor representación de la natural en el entorno de tejido vivo. En tercer lugar, este protocolo permite la adquisición de un número de diferentes parámetros cuantitativos que pueden proporcionar la evaluación objetiva de los cilios móviles función. Por último, en contraste con otros métodos actuales para las vías respiratorias cilios visualización, este protocolo permite la visualización de los cilios en ángulos rectos a la dirección de batido ciliar, permitiendo vista de perfil de los cilios que es óptima para obtener imágenes de alta resolución de batido ciliar y la generación de ondas metachronal .
Este protocolo puede ser modificado en un número de maneras de abordar una amplia gama de necesidades experimentales tales como el papel de los agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco en las vías respiratorias y la función de los cilios generación / mantenimiento de los vías respiratorias batido ciliar y la propagación de ondas metachronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medición de la frecuencia de batido ciliar (CBF) es relativamente fácil de usar objetivos de microscopio de alta potencia y rápida adquisición de imágenes de hardware 13,15, y explica por qué las mediciones CBF forman la base de la mayoría de los estudios de investigación de la depuración mucociliar en la salud y la enfermedad. Sin embargo, mientras que la medición CBF es esencial para la comprensión de la depuración mucociliar, la medición de la CBF solo hace caso omiso de la importancia subyace…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto fue apoyado por el NIH subvención U01HL098180 Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre o de los Institutos Nacionales de la Salud
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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