Ex vivo-metod för högupplöst avbildning av Cilia Motility i Rodent luftvägsepitel
Summary
En enkel och tillförlitlig teknik för att visualisera och kvantifiera motilitet luftvägarna cilier och flimmerhår genererade flödet med mus luftstrupen beskrivs. Denna teknik kan modifieras för att avgöra hur ett stort antal faktorer påverkar cilia motilitet, inklusive farmakologiska medel, genetiska faktorer, miljömässiga exponeringar och / eller mekaniska faktorer såsom slem belastning.
Abstract
En ex vivo teknik för avbildning mus luftvägsepitel för kvantitativ analys av rörliga flimmerhår funktion viktigt för insikt mucociliary clearance funktion har fastställts. Nyskördade mus luftstrupen skärs i längdriktningen genom trachealis muskler och monterad i en grund muromgärdad kammare på ett glas botten maträtt. Luftstrupen Provet är placerad utmed dess längdaxel för att dra nytta av den trachealis muskeln att krypa longitudinellt. Detta tillåter avbildning av ciliär rörelse i profilvyn längs hela trakeal längd. Videoklipp på 200 bilder / sek erhålles med differential mikroskopi interferens kontrast och en hög hastighet digitalkamera för att möjliggöra kvantitativ analys av cilia svävningsfrekvensen och ciliary vågform. Med tillägg av fluorescerande pärlor under avbildning, även flimmerhår genererade vätskeflöde kan bestämmas. Protokollet tidsperioderna ca 30 min, med 5 min för kammare beredning, 5-10 min för provmontering, och 10-15 min för videomikroskopi.
Introduction
Analys av rörliga flimmerhår funktion i luftvägsepitel är experimentellt betydelse för undersökningen av de genetiska och miljömässiga faktorer som kan påverka mucociliary clearance och pulmonell hälsa 1. Den enkla protokoll som utvecklats för avbildning musen luftvägsepitel ger en effektiv metod för att förhöra motilitet luftvägarna flimmerhår i mutant och knockout musmodeller och kräver endast grundläggande kunskaper i mus trakeal vävnad dissektion och ex vivo avbildning av luftvägarna cilier motilitet med hög upplösning videomikroskopi. Detta protokoll upprättas och förfinats under en storskalig mus mutagenesis skärmen för att möjliggöra snabb utvärdering av rörliga flimmerhår funktion (flimmerhår svävningsfrekvensen, flimmerhår slå form, cilier genererade flöde) i mutanter med medfödd hjärtsjukdom förknippad med heterotaxy 2-5.
Aktuella tekniker som används för att studera motilitet luftvägarna cilier kan grupperas i antingen akut ex vivo typ eller lonGer term in vitro experimentella metoder. Akuta experiment inkluderar ex vivo visualisering av humana nasala / luftvägar borste biopsier 6,7 och analys av enkla tvärgående luftvägarna avsnitt 8. De in vitro-metoder använder olika cellodlingstekniker att generera ark differentierad cilierade epitel, t.ex. i luft vätskegränsytan kulturer eller luftvägarna kulturer fjädring 9-11. Men dessa luftvägsepitel reciliation tekniker kräver mycket stora investeringar i tid och träning innan några användbara cilierade epitelceller produceras för experiment (4-6 veckor 9,10). Medan akut ex vivo analys av luftvägsepitelceller borste biopsier används ofta för kliniska studier, är denna metod inte kan användas musstudier grund förvärras mekanisk vävnadsskada 12.
Tekniken som beskrivs i detta protokoll för analys av mouse luftrör luftvägsepitel är inte bara enkel att utföra, men det kräver inga speciella dissektion kompetens eller någon specialutrustning förutom de standard för avbildning av videomikroskopi. Det finns många fördelar med denna enkelt protokoll. Först, som musen luftstrupen vävnad skörd är snabb och enkel att utföra, gör det för snabb bedömning av luftvägarna flimmerhår funktion i ett stort antal möss. Detta kan inkludera akut analys av de kortsiktiga effekterna av olika in vitro behandlingar. Andra, som en ex vivo teknik förblir cilierade luftvägsepitel fäst vid den underliggande stödjande vävnader och därmed bevara tillhörande cell signalvägar. Därför i jämförelse med in vitro reciliated luftvägsepitel, är detta preparat en bättre representation av den naturliga in vivo vävnad miljö. Tredje, medger detta protokoll förvärv av ett antal olika kvantitativa parametrar som kan ge en objektiv bedömning av rörliga flimmerhår fsmörjelse. Slutligen, i motsats till andra nuvarande metoder för luftvägarna cilier visualisering, ger detta protokoll för visualisering av cilier i rät vinkel mot flimmerhåren slå riktningar, vilket gör profilvy av cilier som är optimal för högupplösande avbildning av cilia beat och metachronal vågalstring .
Detta protokoll kan modifieras på ett antal sätt att hantera ett brett spektrum av experimentella behov såsom den roll av farmakologiska medel, genetiska faktorer, miljömässiga exponeringar och / eller mekaniska faktorer såsom slem belastning på luftvägarna cilier funktion och produktion / underhåll av luftvägarna cilier beat och metachronal vågutbredning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mätning av cilia slagfrekvens (CBF) är relativt lätt att använda höga mål power mikroskop och snabb bildtagning hårdvara 13,15, och förklarar varför CBF mätningar ligger till grund för de flesta studier som undersöker mucociliary clearance vid hälsa och sjukdom. Men medan CBF mätning är väsentliga för förståelsen mucociliary clearance, mätning av CBF enbart ignorerar den underliggande betydelsen av både genererade ciliär flöde och flimmerhår slå vågform, som båda är svårare att m?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet stöddes av NIH bidrag U01HL098180 från National Heart, Lung, and Blood Institute. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Heart, Lung, and Blood Institute eller National Institutes of Health
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O’Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
