Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.
Mukosiliyer temizleme fonksiyonu içgörü için önemli hareketli kirpikler fonksiyonunun kantitatif analiz için görüntüleme fare havayolu epitel için bir ex vivo tekniği kurulmuştur. Taze hasat fare trakea trachealis kas ile uzunlamasına kesilir ve cam dipli çanak sığ bir duvarlı odasında monte edilir. Trakea örnek uzunlamasına kıvrılmasına trachealis kas yararlanmak için uzun ekseni boyunca konumlandırılmış. Bu tüm trakea uzunluğu boyunca profil görünümünde siliyer hareket görüntüleme sağlar. 200 kare / sn video kirpikler yendi frekans ve siliyer dalga kantitatif analiz sağlamak için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ve bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında floresan boncuk eklenmesiyle, kirpikler üretilen sıvı akışı da belirlenebilir. Protokol süresi odası hazırlanması için 5 dakika ile yaklaşık 30 dakika,, örnek için 5-10 dakika açıklıklımontaj ve videomikroskopi için 10-15 dk.
Hava yolu epitel içinde hareketli kirpikler fonksiyon analizi mukosiliyer temizleme ve akciğer sağlığı 1 etkileyebilir genetik ve çevresel faktörlerin ortaya çıkması için deneysel önemlidir. Görüntüleme fare havayolu epitel için geliştirilen basit bir protokol mutant ve nakavt fare modellerinde hava yolu kirpikler motilite sorgulamak için etkili bir yöntem sağlar ve fare trakeal doku diseksiyonu ve yüksek çözünürlüklü videomikroskopi ile hava yolu kirpikler motilite ex vivo görüntüleme sadece temel becerileri gerektirir. Bu protokol heterotaksi 2-5 ile ilişkili konjenital kalp hastalığı olan mutantlar hareketli kirpikler fonksiyonunun hızlı değerlendirme (kirpikler yendi frekans, kirpikler yendi şekli, kirpikler oluşturulan akış) izin vermek için büyük çaplı bir fare mutagenez ekran sırasında kurulan ve rafine oldu.
Havayolu kirpikler hareketliliği incelemek için kullanılan mevcut tekniklerin akut ex vivo türü veya boylam ya toplanabilirin vitro deneysel yaklaşımlar ger terim. Akut deneyler ex vivo insan burun / hava yolu fırça biyopsi görselleştirme 6,7 ve basit enine havayolu bölüm 8 analizini içerir. In vitro yaklaşımlar, hava sıvı arayüzü kültürler ya da hava yolu süspansiyon kültürleri 9-11 gibi farklı siliyalı epitel yaprak oluşturmak için çeşitli hücre kültürü teknikleri kullanmaktadır. Herhangi bir kullanılabilir siliyalı epitel hücreleri deney (4-6 hafta 9,10) için üretilen önce Ancak, bu hava yolu epitel reciliation teknikleri zaman ve eğitim çok önemli bir yatırım gerektirir. Solunum yolu epitel fırça biyopsilerin akut ex vivo analiz yaygın insan klinik çalışmalar için kullanılır, bu yöntem şiddetlenir mekanik doku yaralanması 12 bağlı fare çalışmalarda kullanılabilir değildir.
Mutabakatnamelere analizi için bu protokolde belirtilen tekniğiE trakea hava yolu epitel çalıştırmak için sadece basit değildir, ama özel bir diseksiyon becerileri ne videomikroskopi tarafından görüntüleme için bu standart dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Bu protokol için pek çok avantajı vardır. Fare trakea doku hasat gerçekleştirmek için hızlı ve kolay olduğu gibi, önce, farelerin, çok sayıda hava yolu kirpikler fonksiyonu hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için izin verir. Bu in vitro tedavi farklı kısa vadeli etkileri akut analizi içerebilir. İkinci olarak, bir ex vivo tekniği olan, siliyalı hava yolu epitel bu destek dokularını altta yatan bağlı kalır ve böylece ilgili hücre sinyal yolları korumak. Bu nedenle in vitro reciliated solunum yolu epitel hücrelerinde ile karşılaştırıldığında, bu hazırlık vivo doku ortamda doğal daha iyi bir temsilidir. Üçüncü olarak, bu protokol sağlayan hareketli kirpikler f değerlendirilmesini sağlar farklı kantitatif bir dizi parametre edinimimerhem. Son olarak, havayolu kirpikler görselleştirme için diğer mevcut yöntemlerle aksine, bu protokol kirpikler yendi yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve metachronal dalga üretimi için en uygun olan kirpikler Profil görünümü sağlayan, kirpikler yendi yönüne dik açılarda kirpikler görselleştirme sağlar .
Bu protokol, farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya hava yolu kirpikler fonksiyonu ve üretim / bakım gibi mukus yük gibi mekanik faktörlerin rolü deneysel ihtiyaçlarını geniş bir yelpazede ele yolları bir dizi değiştirilebilir havayolu kirpikler yendi ve metachronal dalga yayılımı.
Kirpikler yendi frekans ölçümü (CBF) yüksek güç mikroskobu amaç ve hızlı görüntü elde etme donanım 13,15 kullanarak nispeten kolaydır, ve CBF ölçümleri sağlık ve hastalık sırasında mukosiliyer klerens araştıran en çalışmaların temelini oluşturan açıklıyor. CBF ölçüm tek başına CBF mukosiliyer temizleme, ölçüm anlamak için gereklidir Ancak, siliyer oluşturulan akış ve ölçmek için daha zor genellikle göz ardı edilir, her ikisi de kirpikler yendi dalga, hem de te…
The authors have nothing to disclose.
Proje, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH hibe U01HL098180 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kalp, Akciğer resmi görüşlerini temsil etmez, ve Kan Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |