Metodo ex vivo per l'imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli
Summary
Una tecnica semplice e affidabile per la visualizzazione e la quantificazione delle vie aeree ciglia motilità e ciglia flusso generato usando il mouse trachea è descritto. Questa tecnica può essere modificato per determinare come una vasta gamma di fattori influenza cilia motilità, compresi agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico muco.
Abstract
È stata stabilita una tecnica ex vivo per l'imaging del mouse epiteli delle vie respiratorie per l'analisi quantitativa della funzione ciglia motile importante per la comprensione funzione della clearance mucociliare. Appena raccolto il mouse trachea è tagliato longitudinalmente attraverso il muscolo trachealis e montato in una camera murata bassa su un piatto fondo di vetro. Il campione trachea è posizionato lungo il suo asse lungo di approfittare del muscolo trachealis ad arricciarsi longitudinalmente. Questo permette l'imaging di movimento ciliare nella vista profilo lungo l'intera lunghezza tracheale. I video a 200 frame / sec si ottengono utilizzando interferenza differenziale microscopia a contrasto e una fotocamera digitale ad alta velocità per consentire l'analisi quantitativa delle ciglia frequenza del battito ciliare e forma d'onda. Con l'aggiunta di perline fluorescenti durante l'imaging, cilia flusso di fluido generato anche può essere determinato. Il tempo di protocollo si estende a circa 30 minuti, con 5 minuti per la preparazione della camera, 5-10 min per campionemontaggio, e 10-15 minuti per videomicroscopia.
Introduction
Analisi della funzione di cilia motili nella epiteli delle vie aeree è sperimentalmente importanti per la comprensione dei fattori genetici e ambientali che possono influenzare la clearance mucociliare e la salute polmonare 1. La semplice protocollo sviluppato per l'imaging del mouse epiteli delle vie aeree fornisce un metodo efficiente per interrogare vie respiratorie ciglia motilità nei modelli mutanti e knockout topo e richiedono solo competenze di base in topo tracheale dissezione dei tessuti ed ex imaging in vivo di vie ciglia motilità con videomicroscopia alta risoluzione. Questo protocollo è stato istituito e perfezionato nel corso di una schermata di mutagenesi del mouse su larga scala per consentire una rapida valutazione della funzione delle ciglia mobili (cilia frequenza del battito, forma battito delle ciglia, ciglia flusso generato) in mutanti con cardiopatia congenita associata a heterotaxy 2-5.
Le attuali tecniche utilizzate per lo studio delle vie respiratorie ciglia motilità possono essere raggruppati in due l'ex vivo tipo acuto o lontermine ger de approcci sperimentali in vitro. Esperimenti acuti includono ex vivo di visualizzazione nasali / vie aeree biopsie spazzola umani 6,7 e analisi di semplici sezioni trasversali 8 vie respiratorie. Gli approcci in vitro utilizzano varie tecniche di coltura cellulare per produrre fogli di differenziata epiteli ciliato, come nelle culture di interfaccia Liquid Air o respiratori sospensione culture 9-11. Tuttavia, queste vie respiratorie epiteli tecniche reciliation richiedono investimenti molto significativo nel tempo e la formazione prima di tutte le cellule epiteliali ciliate utilizzabili sono prodotte per la sperimentazione (4-6 settimane 9,10). Mentre acuta analisi ex vivo delle vie respiratorie epiteliali biopsie pennello sono comunemente utilizzati per gli studi clinici umani, questo metodo non è utilizzabile in studi del mouse a causa di lesioni aggravate tessuto meccanico 12.
La tecnica descritta in questo protocollo per l'analisi del moustracheale e vie aeree epiteli non è solo semplice da eseguire, ma non richiede particolari doti dissezione né le attrezzature specializzate, oltre a quelli standard per l'imaging da videomicroscopia. Ci sono molti vantaggi a questo semplice protocollo. Prima, come mouse trachea raccolta dei tessuti è rapida e facile da eseguire, esso consente la rapida valutazione della funzione cilia vie aeree in un gran numero di topi. Questo può includere analisi acuta degli effetti a breve termine diversi trattamenti in vitro. Secondo, essendo una tecnica ex vivo, l'epitelio ciliato vie respiratorie rimane attaccata ad esso sottostanti tessuti di sostegno e conservano quindi associate percorsi di segnalazione cellulare. Quindi in confronto a in vitro reciliated epiteli delle vie aeree, questa preparazione è una migliore rappresentazione del naturale de ambiente tessuto vivo. Terzo, questo protocollo permette l'acquisizione di una serie di parametri quantitativi differenti che possono fornire la valutazione oggettiva motile cilia funzione. Infine, a differenza di altri metodi attuali per via aerea visualizzazione cilia, questo protocollo permette la visualizzazione delle ciglia perpendicolarmente alla direzione battito ciglia, permettendo vista di profilo delle ciglia che è ottimale per l'imaging ad alta risoluzione del battito ciglia e generazione di onda metacronale .
Questo protocollo può essere modificato in vari modi per affrontare una vasta gamma di esigenze sperimentali come il ruolo di agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico sulla funzione cilia muco delle vie aeree e la generazione / manutenzione di vie respiratorie battito delle ciglia e propagazione delle onde metacronale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Misura della frequenza del battito delle ciglia (CBF) è relativamente facile usando obiettivi del microscopio ad alta potenza e le immagini veloce acquisizione hardware 13,15, e spiega perché le misure CBF sono alla base della maggior parte degli studi indagano clearance mucociliare durante la salute e la malattia. Tuttavia, mentre la misurazione CBF è essenziale per comprendere la clearance mucociliare, la misurazione della CBF solo ignora l'importanza di fondo di entrambi i flussi generati ciliare e …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è stato sostenuto da NIH concedere U01HL098180 dal National Heart, Lung, and Blood Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Heart, Lung, and Blood Institute e il National Institutes of Health
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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