重组工程同源重组构建<em>果蝇</em
Summary
同源重组技术大大推进<em>果蝇</em遗传学通过分子精确的突变使创建。最近通过的重组工程允许一个操作大块的DNA，并将其转化为<em>果蝇</em<sup> 6</sup>。这里介绍的方法，这些技术结合起来，以迅速产生大量的同源重组载体。
Abstract
快速，大规模的内源性基因操纵技术 的持续发展，将扩大利用果蝇作为一种遗传模式生物为人类疾病相关的研究。近年来，人们像同源重组和重组工程技术进步。然而，产生明确的的无效突变或标记内源性蛋白仍然是一个重大的努力，大多数基因。这里，我们描述和展示的技术使用基于重组工程的克隆的方法生成，可用于目标和操作在体内的内源基因位点的载体，具体而言，我们已经建立了三种技术的组合：（1）血液中酒精浓度的转基因/重组工程，（ 2）两端的同源重组（3）网关技术，提供了一个可靠，高效和灵活的方法来处理内源性基因位点的。在这个协议中，我们提供了一步一步的详细信息：（1）设计individua升载体，（2）如何克隆大片段的基因组DNA同源重组到载体，使用间隙维修，及（3）如何更换或标记感兴趣的基因，在这些载体中，使用了第二轮的重组工程。最后，我们也将提供如何调动这些录音带在体内产生的淘汰赛，或通过一个标记基因敲的协议。这些方法可以很容易地采用平行的多个目标，并提供一种装置，用于及时和有效的方式操纵果蝇基因组。
Introduction
清洁分子操纵单个基因在他们的内源性基因位点提供了一个非常宝贵的工具来研究真核细胞生物学相关的问题无数。 果蝇反向遗传技术产生损失的功能基因已被证明是具有挑战性的，直到和他的同事介绍Golic 体内基因靶向使用果蝇 1-3同源重组。他们证明，采用线性的DNA片段从一个集成的转基因构造，可以针对特定的基因位点。这种线性的“捐助”的DNA 在体内产生通过FRT-介导的重组（消费作为环状分子从染色体DNA）大范围核酸酶I-SCEI线性。虽然这种方法已成功地用于生成各种定义的病变，该技术并没有轻松扩展平行的许多基因的操纵，因为每个INDIVI双淘汰赛结构需要不同的定制设计。例如，无缝地操纵使用经典的限制性内切酶/结扎克隆或PCR，以及大小的限制，传统的在体内转化载体的大片段的DNA（> 5 kb的） 在体外的困难往往会干扰同源重组靶向快速创建向量。为了克服这些限制，我们结合重组工程/转基因P [ACMAN系统，它允许子克隆和高达100 kb的DNA的转基因的端部从基因打靶方法建立一个有效的和相对快速的平台，使有利于果蝇基因打靶。
重组介导的基因工程（重组工程）是一个强大的同源重组克隆技术4,5。对比常规的限制性内切酶/连接酶克隆，重组工程并不限于序列或SIZE的操纵DNA。重组工程采用了特殊的大肠杆菌coli菌株，港口重组机制提供了一个有缺陷的λ噬菌体4。最近这种技术已被采用，用于在果蝇 6,7。重组工程在果蝇依赖于修改有条件扩增细菌人工染色体（BAC）载体称为P [ACMAN] 6,7。这个载体进行两个的复制起源：oriV的化学诱导后，其产生的高拷贝数的净化需要大量的DNA测序和胚胎注入和ORIS基础条件下，维持低拷贝数。此外，P [ACMAN]载体配有细菌附着（attB位点）的网站。 attB位点作为基板fC31整合酶介导的转基因在果蝇基因组8,9成预定着陆点，允许注册成立的大型DNA片段。
我们已经产生一个P [ACMAN]载体（以下简称为的P [ACMAN]-KO 1.0），可以用作靶向载体的端部出同源重组10,11。要纳入两端的基因打靶技术的系统中，我们加入了两个FRT和两个I-SCEI网站。我们还包括网关盒，在这个修改后的载体，以简化程序纳入到的P [ACMAN] KO 1.0同源臂。这提供了一种快速和简单的方法到目标载体引入任意感兴趣的基因组区域。在这个协议中，我们将描述如何设计的靶向载体，使用P [ACMAN]-KO 1.0，如何调动此载体在体内的内源基因座定位。对于此协议的目的，我们将使用的RFP /简卡带更换感兴趣的基因，但这个协议，可以使用各种含有抗生素选择标记盒。我们已经设计并成功应用于一组磁带基因置换和标记10,11。
Protocol
Representative Results
Discussion
在很大程度上是基于遗传操作的工具，可用于在生物医学研究中的遗传模式生物的力量。小模型C.线虫和果蝇的特别允许在多细胞发育或功能完整的途径和基因家族牵连的廉价和快速的分子遗传分析。近年来出现了显着进步，工具开发，操纵基因在果蝇 14,15。例如，重组工程，它被广泛应用于在小鼠遗传学操纵Bac的DNA构建体，最近为果蝇适应，通过使用的P [ACMAN]…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢雨果韶远试剂和布卢明顿库存中心。我们还要感谢公园Venken韶远，雨果和所有成员的Buszczak Hiesinger实验室的有益讨论。支持这项工作是由美国国家卫生研究院ACR（T32GM083831）的，公屋（RO1EY018884）的赠款和MB（RO1GM086647），授予德州癌症预防研究所以MB和公屋（RP100516），韦尔奇基金会（I-1657）公屋。 MB是在生物医学研究和公屋EE和格里尔加森•弗格森学者尤金·麦克德莫特学者在得克萨斯大学西南医学中心生物医学研究中。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
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