Recombineering مثلي التركيبات التوحد في<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
مثلي تقنيات إعادة التركيب تقدم كبير<em> ذبابة الفاكهة</em> علم الوراثة من خلال تمكين إنشاء الطفرات دقيقة جزيئيا. اعتماد الأخيرة من recombineering يسمح احد للتلاعب قطعة كبيرة من الحمض النووي وتحويلها إلى<em> ذبابة الفاكهة</em<sup> 6</sup>. الأساليب المقدمة هنا الجمع بين هذه التقنيات لتوليد بسرعة كبيرة مثلي ناقلات إعادة التركيب.
Abstract
سوف التطوير المستمر لتقنيات سريع، والتلاعب على نطاق واسع من مواضع الجينات الذاتية توسيع استخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن باعتباره النموذج الحي الوراثية للبحوث المتصلة الأمراض التي تصيب البشر. وقد شهدت السنوات الأخيرة التقدم التقني مثل إعادة التركيب مثلي وrecombineering. ومع ذلك، وتوليد الطفرات باطل لا لبس فيه أو البروتينات الذاتية علامات يبقى جهدا كبيرا لمعظم الجينات. هنا، نحن تصف وشرح تقنيات واستخدام أساليب الاستنساخ القائم على recombineering لتوليد نواقل التي يمكن استخدامها لاستهداف ومعالجة مواضع الذاتية في الجسم الحي على وجه التحديد، وقد أنشأنا مجموعة من ثلاث تقنيات: (1) نقل الجينات BAC / recombineering، ( 2) تنتهي إجراءات المغادرة مثلي إعادة التركيب و (3) التكنولوجيا بوابة لتوفير وسيلة قوية وفعالة ومرنة لمعالجة مواضع الجيني الذاتية. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم التفاصيل خطوة بخطوة حول كيفية (1) تصميم individuaناقلات لتر، (2) كيفية استنساخ شظايا كبيرة من الحمض النووي الجيني في ناقلات إعادة التركيب مثلي باستخدام إصلاح الفجوة، و (3) كيفية استبدال أو علامة الجينات في المصالح داخل هذه النواقل باستخدام الجولة الثانية من recombineering. وأخيرا، فإننا نقدم أيضا بروتوكول لكيفية تعبئة هذه الأشرطة في الجسم الحي لتوليد بالضربة القاضية، أو الجينات المرتبطة دلاليا عبر الضربة القاضية في. ويمكن بسهولة أن اعتمدت هذه الأساليب لأهداف متعددة في نفس الوقت وتوفير وسيلة لمعالجة جينوم ذبابة الفاكهة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة.
Introduction
تنظيف التلاعب المعرفة جزيئيا من الجينات واحد في مواضع بهم الذاتية تقدم أداة لا تقدر بثمن لدراسة عدد لا يحصى من الأسئلة ذات الصلة لعلم الأحياء حقيقية النواة. ذبابة الفاكهة عكس التقنيات الوراثية لتوليد الأليلات الخسارة من وظيفة قد ثبت أن تكون صعبة حتى قدم [غليك] وزملاؤه في استهداف الجينات في الجسم الحي باستخدام إعادة التركيب مثلي لذبابة الفاكهة 1-3. وأظهروا أن يمكن استهداف مواضع الجيني محددة باستخدام جزء طولي من الحمض النووي من بناء متكامل المعدلة وراثيا. يتم إنشاء هذا خطي DNA "المانحة" في الجسم الحي من خلال إعادة التركيب FRT بوساطة (لاستئصال الحمض النووي من الكروموسوم كما جزيء دائري)، يليه الخطية مع meganuclease I-SCEI. على الرغم من أن هذه المنهجية استخدمت بنجاح لتوليد مجموعة متنوعة من الآفات محددة، ولم تكن هذه التقنية قابلة للتطوير بسهولة للتلاعب العديد من الجينات في نفس الوقت لأن كل indiviبناء خروج المغلوب المزدوج يتطلب تصميم متميز والعرف. على سبيل المثال، صعوبات في التلاعب بسلاسة شظايا كبيرة من الحمض النووي (> 5 KB) في المختبر باستخدام الكلاسيكية تقييد انزيم / ربط استنساخ أو PCR، فضلا عن القيود التقليدية في حجم ناقلات تحول الجسم الحي في كثير من الأحيان تتداخل مع التولد السريع لإعادة التركيب مثلي استهداف ناقلات. للتغلب على هذه القيود، ونحن الجمع بين P [acman] نظام recombineering / نقل الجينات، والذي يسمح الفرعي الاستنساخ ونقل الجينات تصل إلى 100 كيلو بايت من الحمض النووي، مع استهداف نهايات المغادرة الجين منهجية لتأسيس منصة فعالة وسريعة نسبيا والتي يسهل استهداف الجين ذبابة الفاكهة.
إعادة التركيب بوساطة الهندسة الوراثية (recombineering) هي قوية القائم على إعادة التركيب مثلي تكنولوجيا الاستنساخ 4،5. وعلى النقيض من التقليدية تقييد انزيم / يغاز الاستنساخ، recombineering لا يقتصر بواسطة تسلسل أو الاحجام(ه) من الحمض النووي التلاعب بها. يستخدم Recombineering لE. خاص سلالة القولونية التي تؤوي آلات إعادة التركيب التي يقدمها λ معيبة طليعة العاثية 4. وقد اعتمدت هذه التقنية مؤخرا لاستخدامها في ذبابة الفاكهة 6،7. Recombineering في ذبابة الفاكهة تعتمد على amplifiable مشروط كروموسوم اصطناعي البكتيرية المعدلة (BAC) ناقلات دعا P [acman] 6،7. هذا ناقلات تحمل اثنين من أصل النسخ المتماثل: OriV، التي تنتج رقم ونسخة عالية على الاستقراء الكيميائية لتنقية كميات كبيرة من الحمض النووي المطلوبة لتسلسل وحقن الجنين وأوريس، التي تحافظ على رقم ونسخة منخفضة في ظل ظروف القاعدية. بالإضافة إلى ذلك، ف [acman] وقد تم تجهيز ناقلات مع المرفقات (attB) موقع البكتيرية. موقع attB بمثابة الركيزة لΦC31 integrase بوساطة نقل الجينات التي تسمح بإدماج شظايا الحمض النووي كبير في موقع الهبوط محددة سلفا داخل ذبابة الفاكهة الجينوم 8،9.
لقد ولدت P [acman] ناقلات (المشار إليها باسم P [acman]-KO 1.0) التي يمكن استخدامها كناقل استهداف لغايات المغادرة مثلي إعادة التركيب 10،11. لدمج إنتهاء المغادرة استهداف الجينات التكنولوجيا في النظام، واضاف نحن اثنان FRT وموقعين I-SCEI. لقد تضمنت ايضا كاسيت بوابة ضمن هذه النواقل تعديل لتبسيط عملية دمج الأسلحة تناظر إلى P [acman]-KO 1.0. هذا يوفر وسيلة سريعة وبسيطة لإدخال عمليا أي منطقة الجيني من الفائدة في ناقلات الاستهداف. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح كيفية مهندس ناقلات استهداف باستخدام P [acman]-KO 1.0، وكيفية تعبئة هذه النواقل في الجسم الحي لاستهداف موضع الذاتية. لغرض هذا البروتوكول سوف نستخدم RFP / اساسه كاسيت ليحل محل الجينات في المصالح، ولكن مجموعة متنوعة من أشرطة الكاسيت التي تحتوي على علامة اختيار المضادات الحيوية يمكن استخدامها مع هذا البروتوكول. لقد قمنا بتصميم واستخدمت بنجاح مجموعة من أشرطة الكاسيت للاستبدال الجينات ووضع علامات 10،11.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند قوة الكائنات نموذج الجينية في مجال البحوث الطبية الحيوية إلى حد كبير على الأدوات المتاحة للتلاعب الجيني. نماذج صغيرة C. ايليجانس وذبابة الفاكهة على وجه الخصوص تسمح للتحاليل وراثية جزيئية غير مكلفة وسريعة من مسارات كاملة وعائلات الجينات المتورطين في التن…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر هوغو Bellen ومركز الأسهم بلومنجتون لالكواشف. نشكر مزيد كوين Venken، هوغو Bellen وجميع أعضاء مختبرات Buszczak وHiesinger لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة إلى ACR (T32GM083831)، PRH (RO1EY018884) وMB (RO1GM086647)، وهو منحة من الوقاية من السرطان معهد بحوث من تكساس إلى MB وPRH (RP100516)، وولش مؤسسة (I-1657) إلى PRH. MB هو EE وغرير غارسون Fogelson الباحث العلمي في أبحاث الطب الحيوي وPRH هو ماكديرموت الباحث يوجين في البحوث الطبية الحيوية في UT مركز ساوث ويسترن الطبي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Génétique. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Génétique. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
