Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em> Drosophila</em
Summary
Homologe Rekombination Techniken stark voranbringen<em> Drosophila</em> Genetik, indem sie die Erstellung von molekular genauen Mutationen. Die jüngste Verabschiedung Rekombination ermöglicht es, große Stücke von DNA manipulieren und transformieren sie in<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. Die hier vorgestellten Methoden kombinieren diese Techniken, um schnell erzeugen große homologe Rekombination Vektoren.
Abstract
Die Weiterentwicklung von Techniken für schnelle, großflächige Manipulation der endogenen Genorte verbreitern den Einsatz von Drosophila melanogaster als genetischer Modellorganismus für menschliche Krankheiten Forschung. In den letzten Jahren haben technische Fortschritte wie die homologe Rekombination und Rekombination gesehen. Allerdings erzeugt eindeutige Null-Mutationen oder Tagging endogenen Proteinen bleibt ein erheblicher Aufwand für die meisten Gene. Hier beschreiben wir demonstrieren und Techniken für den Einsatz Recombineering-basierte Klonen Methoden, um Vektoren, die verwendet werden, um gezielt zu manipulieren und endogenen Loci in vivo zu generieren Insbesondere haben wir eine Kombination von drei Technologien etabliert:. (1) BAC Transgenese / Rekombination, ( 2) Enden-out homologen Rekombination und (3) Gateway-Technologie, um eine stabile, effiziente und flexible Verfahren zum Manipulieren endogenen genomischen Loci. In diesem Protokoll, bieten wir Ihnen Schritt-für-Schritt-Anweisungen, wie man (1) Design individual Vektoren, (2) wie man große Fragmente genomischer DNA in der homologen Rekombination mit Vektor Lücke Reparatur, und (3) wie zu ersetzen oder zu kennzeichnen Gene von Interesse innerhalb dieser Vektoren mit einem zweiten Runde der Rekombination klonen. Schließlich werden wir auch ein Protokoll, wie Sie diese Kassetten in vivo zu mobilisieren, um einen Knockout oder eine markierte Gen über Knock-in generieren. Diese Methoden können leicht für mehrere Ziele parallel angenommen werden und ein Mittel zur Manipulation der Drosophila-Genom in eine rechtzeitige und effiziente Art und Weise.
Introduction
Reinigen molekular definierten Manipulationen einzelner Gene auf ihre endogenen Loci bieten ein unschätzbares Werkzeug, um eine Vielzahl von relevanten Fragen eukaryotischen Biologie zu studieren. Drosophila umkehren genetische Techniken zur Erzeugung von loss-of-function-Allele hatten nachweislich eine Herausforderung sein, bis Golic und Kollegen de eingeführt vivo Gen-Targeting mit homologe Rekombination Drosophila 1-3. Sie zeigten, dass spezifische Loci konnten gezielt mit einem linearen DNA-Fragment von einem integrierten transgenen Konstrukts werden. Diese lineare "Donor"-DNA wird in vivo durch FRT-vermittelte Rekombination (Verbrauchsteuerpflichtige die DNA aus dem Chromosom eines ringförmigen Moleküls) durch Linearisierung der Meganuclease I-SceI gefolgt erzeugt. Obwohl diese Methode wurde erfolgreich verwendet worden, um eine Vielzahl von definierten Läsionen zu erzeugen, ist die Technik nicht leicht skalierbar zur Manipulation zahlreicher Gene in parallel, weil jeder einzelnenDual-Knockout-Konstrukt erfordert deutliche und individuelles Design. Beispielsweise Schwierigkeiten nahtlos Umgang mit großen DNA-Fragmente (> 5 kb) in vitro unter Verwendung klassischer Restriktionsenzym / Ligation Klonen oder PCR, sowie die Größe Einschränkungen herkömmlicher in vivo Transformationsvektoren oft die schnelle Entwicklung der homologen Rekombination gezielt beeinflussen Vektoren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, kombinierten wir die Rekombination / Transgenese P [Pacman]-System, das die Sub-Klonierung und Transgenese von bis zu 100 kb ermöglicht der DNA, wobei die Enden-out Gen-Targeting-Methoden, um eine effiziente und relativ schnelle Plattform zu etablieren, dass erleichtert Drosophila Gen-Targeting.
Rekombination vermittelte Gentechnik (Rekombination) ist ein leistungsfähiges homologe Rekombination basierende Technologie des Klonens 4,5. Im Gegensatz zu herkömmlichen Restriktionsenzym / Ligase Klonen wird nicht durch Rekombination der Sequenz oder siz begrenzte der manipulierten DNA. Recombineering verwendet eine spezielle E. coli-Stamm, der Rekombination Maschinen durch eine defekte λ Prophagen 4 vorgesehen birgt. Diese Technik wurde kürzlich für den Einsatz in Drosophila 6,7 angenommen worden. Recombineering in Drosophila beruht auf einer modifizierten bedingt amplifizierbare bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Vektor genannt P [Pacman] 6,7. Dieser Vektor trägt zwei Replikationsstartpunkte: oriV, die hohe Kopienzahl produziert auf chemische Induktion für die Reinigung von großen Mengen an DNA für die Sequenzierung und Embryo-Einspritzung und Oris, die Low-Kopienzahl unterhält unter basalen Bedingungen erforderlich. Zusätzlich wird die P [Pacman] Vektor wird mit einer bakteriellen Befestigung (attB) Website ausgestattet. Die attB-Stelle dient als Substrat für ΦC31 Integrase-vermittelten Gentransfer, dass der Einbau von großen DNA-Fragmente können in eine vorbestimmte Landeplatz im Drosophila Genom 8,9.
Wir haben ein P [Pacman] Vektor (bezeichnet als P [Pacman]-KO 1.0), die als Targeting-Vektor für Enden-out homologe Rekombination 10,11 verwendet werden können, erzeugt. Um übernehmen Enden-out-Gen-Targeting-Technologie in das System, haben wir zwei FRT und zwei I-SceI-Websites. Wir haben auch eine Gateway-Kassette in diesem modifizierten Vektor, um den Prozess der Einarbeitung der Homologie Arme in P [Pacman]-KO 1.0 straffen enthalten. Dies stellt eine schnelle und einfache Art und Weise nahezu jede genomischen Region von Interesse in den Targeting-Vektor einzuführen. In diesem Protokoll werden wir beschreiben, wie ein Targeting-Vektor mit P [Pacman]-KO 1.0, und wie man diesen Vektor in vivo mobilisieren, um die endogenen Locus gezielt konstruieren. Für die Zwecke dieses Protokolls verwenden wir den RFP / Kan-Kassette, ein Gen von Interesse zu ersetzen, sondern eine Vielzahl von Kassetten, die ein Antibiotikum Selektionsmarker enthalten, können mit diesem Protokoll verwendet werden. Wir haben entworfen und erfolgreich eingesetzt eine Reihe von Kassetten fürGen-Ersatz-und-Tagging 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Macht der genetischen Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung wird weitgehend auf den verfügbaren Werkzeugen zur genetischen Manipulation basiert. Die kleinen Modelle C elegans und Drosophila insbesondere ermöglichen kostengünstige und schnelle molekulargenetische Analysen von kompletten Wege und Gen-Familien in vielzelligen Entwicklung oder Funktion gebracht. In den letzten Jahren bedeutende Fortschritte in der Entwicklung von Werkzeugen für die Manipulation von Genen in Drosoph…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Hugo Bellen und Bloomington Stock Center für Reagenzien danken. Wir danken Koen weiter Venken, Hugo Bellen und alle Mitglieder der Buszczak und Hiesinger Labors für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health in ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) und MB (RO1GM086647), einen Zuschuss von der Cancer Prevention Research Institute of Texas in MB und PRH (RP100516) und der Welch unterstützt Foundation (I-1657), um PRH. MB ist ein EE und Greer Garson Fogelson Scholar in der biomedizinischen Forschung und PRH ist ein Eugene McDermott in Biomedical Research Scholar am UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
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