Recombineering הומולוגי רקומבינציה בבונה<em> דרוזופילה</em
Summary
הומולוגי רקומבינציה טכניקות מאוד לקדם<em> דרוזופילה</em> גנטיקה כך שהיא מאפשרת יצירת מוטציות מולקולריות מדויקות. האימוץ האחרון של recombineering מאפשר לתפעל את החתיכות גדולות של ה-DNA ולהפוך אותם<em> דרוזופילה</em<sup> 6</sup>. השיטות שהוצגו כאן משלבים טכניקות אלה כדי ליצור במהירות הומולוגי רקומבינציה וקטורים גדולים.
Abstract
המשך הפיתוח של טכניקות למניפולציה מהירה, בקנה מידה גדולה של לוקוסי גנים אנדוגניים יהיה להרחיב את השימוש בתסיסנית כאורגניזם מודל גנטי למחקר הקשור לאדם מחלה. בשנים אחרונות חלו התקדמות טכנולוגית כמו הומולוגי רקומבינציה וrecombineering. עם זאת, יצירת מוטציות null חד משמעיות או חלבונים אנדוגניים תיוג נשארה מאמץ משמעותי עבור רוב הגנים. כאן, אנו מתארים ומדגימים טכניקות לשימוש בשיטות שיבוט מבוססות recombineering לייצר וקטורים שניתן להשתמש בם כדי למקד ולטפל לוקוסים אנדוגניים in vivo באופן ספציפי, הקמנו שילוב של שלוש טכנולוגיות:. (1) transgenesis BAC / recombineering, ( 2) (3) טכנולוגית Gateway הומולוגית רקומבינציה קצוות החוצה וכדי לספק שיטה יציבה, יעילה וגמישה למניפולצית לוקוסים הגנומי אנדוגניים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים פרטי צעד אחר צעד על איך (1) העיצוב individuaוקטורי l, (2) איך לשכפל ברים גדולים של הדנ"א הגנומי לתוך וקטור רקומבינציה הומולוגית באמצעות תיקון פער, ו (3) איך להחליף או לתייג את הגנים של עניין בתוך וקטורים אלה באמצעות סיבוב שני של recombineering. לבסוף, אנו גם מספקים פרוטוקול לאיך לגייס את הקלטות הללו in vivo כדי לייצר פצצה, או גן מתויג באמצעות דפיקה ב. בקלות ניתן לאמץ שיטות אלה למטרות מרובות במקביל ולספק אמצעי למניפולציה של הגנום דרוזופילה במועד ויעיל.
Introduction
נקה מניפולציות מולקולריות מוגדרות של גנים בודדים בלוקוסים אנדוגניים מציעים כלי רב ערך כדי ללמוד מספר עצום של שאלות רלוונטיות לביולוגיה אוקריוטים. תסיסנית להפוך טכניקות גנטיות ליצירת אללים אובדן של פונקציה שהוכיחה להיות מאתגרים עד Golic ועמיתיו הציגו בשנת מיקוד גן vivo באמצעות הומולוגי רקומבינציה לדרוזופילה 1-3. הם הוכיחו כי לוקוסים הגנומי ספציפיים יכולים להיות ממוקדים באמצעות שבר ליניארי של DNA ממבנה מהונדס משולב. דנ"א זה ליניארי "תורם" נוצר in vivo באמצעות רקומבינציה FRT בתיווך (לבלו את ה-DNA מכרומוזום כמולקולה מעגלית) ואחריו ינאריזציה עם meganuclease I-SCEI. למרות שמתודולוגיה זו שימש בהצלחה ליצירת מגוון רחב של נגעים מוגדרים, הטכניקה לא הייתה להרחבה בקלות למניפולציה של גנים רבים במקביל כי כל indiviדורש מבנה נוקאאוט כפול עיצוב ייחודי ומותאם אישית. לדוגמה, קשיים בצורה חלקה מניפולציה שברים גדולים של ה-DNA (> 5 קילו) במבחנה באמצעות אנזים הגבלה קלסית / קשירה או שיבוט PCR, כמו גם את מגבלות הגודל של מסורתי בוקטורי שינוי vivo לעתים קרובות מפריעים ליצירה המהירה של הומולוגי רקומבינציה מיקוד וקטורים. כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנחנו בשילוב P [acman] מערכת recombineering / transgenesis, המאפשר תת השיבוט וtransgenesis של עד 100 קילו של ה-DNA, עם קצוות החוצה גן מיקוד המתודולוגיה להקים פלטפורמה יעילה ומהירה יחסית כי הגן מאפשר תסיסנית מיקוד.
רקומבינציה בתיווך הנדסה גנטית (recombineering) היא הומולוגי רקומבינציה מבוססת טכנולוגיית שיבוט עוצמה 4,5. בניגוד לשיבוט אנזים / האנזים הגבלה קונבנציונלי, recombineering אינו מוגבל על ידי הרצף או sizדואר של ה-DNA מניפולציות. Recombineering משתמש א 'מיוחד זן חיידק שמטפח מכונות רקומבינציה מסופקות על ידי λ פגום prophage 4. טכניקה זו אומצה לאחרונה לשימוש בדרוזופילה 6,7. Recombineering בדרוזופילה מסתמך על כרומוזום שונה מותנה amplifiable קטריאלי מלאכותי (BAC) וקטור נקרא P [acman] 6,7. וקטור זה נושא שני מקורותיה של שכפול: OriV, אשר מייצר מספר גבוה עותק על זירוז כימי לטיהור כמויות גדולות של DNA הנדרשות לריצוף והזרקת עובר וOris, אשר שומר על מספר נמוך עותק בתנאים בסיסיים. בנוסף, P [acman] הווקטור מצויד באתר מצורף חיידקים (attB). אתר attB משמש כמצע לΦC31 transgenesis integrase בתיווך המאפשר שילוב של קטעי דנ"א גדולים לתוך אתר נחיתה קבוע מראש בתוך הגנום תסיסנית 8,9.
יש לנו שנוצרו P [acman] וקטור (המכונה P [acman]-KO 1.0) שיכול לשמש כוקטור למיקוד מסתיים החוצה הומולוגי רקומבינציה 10,11. לשלב קצוות החוצה גן מיקוד טכנולוגיה למערכת, הוספנו שניים FRT ושני אתרי I-SCEI. יש לנו גם כללו קלטת שער בתוך וקטור שונה זה כדי לייעל את התהליך של שילוב זרועות ההומולוגיה לP [acman]-KO 1.0. זה מספק דרך מהירה ופשוטה כדי להציג כמעט כל אזור גנומי עניין לתוך וקטור המיקוד. בפרוטוקול זה נתאר כיצד להנדס וקטור באמצעות מיקוד P [acman]-KO 1.0, ואיך לגייס את הווקטור הזה in vivo למקד את לוקוס אנדוגני. לצורך הפרוטוקול זה אנו נשתמש בקלטת RFP / קאן להחליף גן של עניין, אלא מגוון רחב של קלטות המכילות סמן בחירת אנטיביוטיקה ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. יש לנו תוכננו ושימש בהצלחה סדרה של קלטות עבורהחלפת גן ותיוג 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
כוחו של אורגניזמים מודל גנטיים במחקר ביו מבוסס במידה רבה על הכלים הזמינים למניפולציה גנטית. הדגמים הקטנים ג elegans ותסיסנית בפרט יאפשר לניתוח גנטי מולקולרי זול ומהיר של מסלולים שלמים ומשפחות הגן מעורבים בהתפתחות או תפקוד רב תאיים. בשנים אחרונות חלו התקדמות משמעו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לוגו Bellen ומרכז מאגר בלומינגטון לחומרים כימיים. בנוסף, אנו מודים כהן Venken, הוגו Bellen וכל חברי Buszczak וHiesinger המעבדות לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) ומגה (RO1GM086647), מענק על ידי מניעת סרטן מכון המחקר של טקסס למגה וPRH (RP100516), וולץ' קרן (I-1657) לPRH. מגה הוא א 'א' וגריר גרסון Fogelson Scholar במחקר ביו וPRH הוא חוקר יוג'ין מק 'דרמוט במחקר ביו במרכז רפואי UT Southwestern.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Génétique. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Génétique. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
