में मुताबिक़ पुनर्संयोजन Constructs Recombineering<em> ड्रोसोफिला</em
Summary
मुताबिक़ पुनर्संयोजन तकनीक बहुत अग्रिम<em> ड्रोसोफिला</em> Molecularly सटीक परिवर्तन के निर्माण को सक्षम करने से आनुवंशिकी. recombineering की हाल ही में गोद लेने की एक डीएनए के बड़े टुकड़ों में हेरफेर और उन में परिणत करने के लिए अनुमति देता है<em> ड्रोसोफिला</em<sup> 6</sup>. तरीकों तेजी से बड़े मुताबिक़ पुनर्संयोजन वैक्टर उत्पन्न करने के लिए इन तकनीकों का गठबंधन यहां प्रस्तुत किया.
Abstract
अंतर्जात जीन loci के तेजी से, बड़े पैमाने पर हेरफेर के लिए तकनीक के निरंतर विकास के मानव रोग से संबंधित अनुसंधान के लिए एक आनुवंशिक मॉडल जीव के रूप में ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का उपयोग व्यापक होगा. हाल के वर्षों के मुताबिक़ पुनर्संयोजन और recombineering तरह तकनीकी प्रगति को देखा है. हालांकि, स्पष्ट अशक्त म्यूटेशन या टैगिंग अंतर्जात प्रोटीन पैदा ज्यादातर जीनों के लिए एक बड़ा प्रयास रहता है. यहाँ, हम vivo में अंतर्जात स्थलों को निशाना बनाने और हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वैक्टर उत्पन्न करने recombineering आधारित क्लोनिंग तरीकों का उपयोग करने के लिए तकनीक का वर्णन है और दिखाना है विशेष रूप से, हम तीन प्रौद्योगिकियों के संयोजन की स्थापना की है. (1) बीएसी transgenesis / recombineering, ( 2) सिरों से बाहर मुताबिक़ पुनर्संयोजन और (3) गेटवे प्रौद्योगिकी अंतर्जात जीनोमिक loci जोड़ तोड़ के लिए एक मजबूत, कुशल और लचीला तरीका प्रदान करने के लिए. इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे (1) डिजाइन individua करने के बारे में कदम दर कदम विवरण प्रदानएल वैक्टर, (2) के अंतर की मरम्मत, और (3) कैसे recombineering के दूसरे दौर का उपयोग कर इन वैक्टर भीतर ब्याज की जीन को बदलने या टैग करने के लिए उपयोग कर मुताबिक़ पुनर्संयोजन वेक्टर में जीनोमिक डीएनए के बड़े टुकड़े क्लोन करने के लिए कैसे. अंत में, हम भी एक पीटा, या दस्तक के माध्यम से एक टैग जीन उत्पन्न करने के लिए vivo में इन कैसेटों को लामबंद करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करेगा. इन तरीकों को आसानी से समानांतर में कई लक्ष्यों के लिए अपनाया और एक समय और कुशल तरीके से ड्रोसोफिला जीनोम से छेड़छाड़ के लिए एक साधन प्रदान किया जा सकता है.
Introduction
उनके अंतर्जात loci में एक जीन की molecularly परिभाषित जोड़तोड़ साफ यूकेरियोटिक जीव विज्ञान से संबंधित प्रश्नों की एक बहुत बड़ी संख्या का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं. ड्रोसोफिला नुकसान के समारोह alleles के सृजन के लिए आनुवंशिक तकनीक रिवर्स Golic और उनके सहयोगियों में शुरू की जब तक चुनौतीपूर्ण हो करने के लिए साबित हो गया था विवो जीन ड्रोसोफिला 1-3 करने के मुताबिक़ पुनर्संयोजन का उपयोग कर निशाना. वे कहते हैं कि विशिष्ट जीनोमिक loci एक एकीकृत ट्रांसजेनिक निर्माण से डीएनए के एक रेखीय टुकड़ा का उपयोग लक्षित किया जा सकता का प्रदर्शन किया. इस रैखिक "दाता" डीएनए meganuclease मैं SCEI साथ linearization द्वारा पीछा FRT की मध्यस्थता पुनर्संयोजन (उत्पाद शुल्क को एक परिपत्र अणु के रूप में गुणसूत्र से डीएनए) के माध्यम से इन विवो में उत्पन्न होता है. इस पद्धति को सफलतापूर्वक परिभाषित घावों की एक किस्म उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, तकनीक समानांतर में कई जीन की हेरफेर के लिए आसानी से स्केलेबल नहीं किया गया है क्योंकि प्रत्येक व्यक्तिगतदोहरी पीटकर निर्माण विशिष्ट और कस्टम डिजाइन की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, मूल शास्त्रीय प्रतिबंध एंजाइम / बंधाव क्लोनिंग या पीसीआर, साथ ही इन विवो परिवर्तन वैक्टर में पारंपरिक का आकार सीमाओं का उपयोग कर इन विट्रो में डीएनए (> 5 केबी) के बड़े टुकड़े जोड़ तोड़ में कठिनाइयों अक्सर लक्षित कर मुताबिक़ पुनर्संयोजन का तेजी से निर्माण के साथ हस्तक्षेप वैक्टर. इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम सिरों से बाहर जीन एक कुशल और अपेक्षाकृत तेजी से मंच की स्थापना के लिए कार्यप्रणाली को निशाना बनाने के साथ, डीएनए के 100 केबी तक की उप क्लोनिंग और transgenesis की अनुमति देता है जो recombineering / transgenesis पी [acman] प्रणाली, संयुक्त कि ड्रोसोफिला जीन को निशाना बनाने की सुविधा.
पुनर्संयोजन की मध्यस्थता जेनेटिक इंजीनियरिंग (recombineering) 4,5 एक शक्तिशाली मुताबिक़ पुनर्संयोजन आधारित क्लोनिंग तकनीक है. पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम / ligase क्लोनिंग के विपरीत, recombineering अनुक्रम या siz के द्वारा ही सीमित नहीं हैचालाकी से डीएनए के ए. Recombineering एक विशेष ई. का उपयोग करता है एक दोषपूर्ण λ prophage 4 द्वारा प्रदान पुनर्संयोजन मशीनरी बंदरगाहों कि कोलाई तनाव. इस तकनीक को हाल ही में ड्रोसोफिला 6,7 में उपयोग के लिए अपनाया गया है. ड्रोसोफिला में Recombineering पी [acman] 6,7 नामक एक संशोधित सशर्त amplifiable जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) वेक्टर पर निर्भर करता है. OriV, अनुक्रमण और भ्रूण इंजेक्शन और बेसल शर्तों के तहत कम प्रतिलिपि संख्या रखता है जो श्वास, के लिए आवश्यक डीएनए की बड़ी मात्रा की शुद्धि के लिए रासायनिक प्रेरण पर उच्च प्रतिलिपि संख्या जो उत्पादन: इस वेक्टर प्रतिकृति के दो मूल वहन करती है. इसके अतिरिक्त, पी [acman] वेक्टर एक जीवाणु लगाव (attB) साइट के साथ सुसज्जित है. attB साइट ड्रोसोफिला जीनोम 8,9 भीतर एक पूर्व निर्धारित लैंडिंग साइट में बड़े डीएनए टुकड़े के समावेश की अनुमति देता है कि ΦC31 इंटिग्रेस की मध्यस्थता transgenesis के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है.
हम समाप्त होता है से बाहर मुताबिक़ पुनर्संयोजन 10,11 के लिए एक लक्ष्य वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक पी [acman] वेक्टर (पी [acman] को 1.0 कहा जाता है) उत्पन्न किया है. प्रणाली में प्रौद्योगिकी को निशाना बनाने को शामिल करने के लिए समाप्त हो जाती है, बाहर जीन, हम दो FRT और दो मैं SCEI साइटों गयी. हम भी पी [acman] को 1.0 में समरूपता के हथियारों को शामिल करने की प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए इस संशोधित वेक्टर भीतर एक गेटवे कैसेट को शामिल किया है. यह लक्षित कर वेक्टर में ब्याज के लगभग किसी भी जीनोमिक क्षेत्र लागू करने के लिए एक तेजी से और आसान तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल में हम पी [acman] को 1.0, और कैसे अंतर्जात ठिकाना लक्षित करने के लिए vivo में इस वेक्टर जुटाने के लिए उपयोग कर एक को लक्षित वेक्टर इंजीनियर के लिए का वर्णन करेंगे. इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य के लिए हम ब्याज की एक जीन को बदलने के लिए आरएफपी / कान कैसेट का उपयोग करेगा, लेकिन एक एंटीबायोटिक चयन मार्कर होते हैं कि कैसेट की एक किस्म इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा सकता है. हम कैसेट का एक सेट के लिए बनाया गया है और सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया हैजीन प्रतिस्थापन और टैगिंग 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
जैव चिकित्सा अनुसंधान में आनुवंशिक मॉडल जीवों की शक्ति काफी हद तक आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपलब्ध उपकरणों पर आधारित है. छोटे मॉडल सी. विशेष रूप से एलिगेंस और ड्रोसोफिला बहुकोशिकीय विकास या सम?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ह्यूगो Bellen और अभिकर्मकों के लिए ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम आगे उपयोगी विचार विमर्श के लिए कोएन Venken, ह्यूगो Bellen और Buszczak और Hiesinger प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद. इस काम के आर करने के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) से अनुदान द्वारा और एमबी (RO1GM086647), एमबी और PRH (RP100516) को टेक्सास के कैंसर की रोकथाम रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा एक अनुदान, और वेल्च को समर्थन किया था PRH के लिए फाउंडेशन (मैं-1657). एमबी जैव चिकित्सा अनुसंधान और PRH में एक ई और ग्रीर Garson Fogelson विद्वान है UT दक्षिण मेडिकल सेंटर में जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक यूजीन मैकडरमोट विद्वान है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
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