Homolog rekombinasjon teknikker sterkt fremme<em> Drosophila</em> Genetikk ved å muliggjøre etableringen av molekylært presise mutasjoner. Den nylige innføringen av recombineering gjør det mulig å manipulere store biter av DNA og forvandle dem til<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. Metodene som presenteres her kombinere disse teknikkene til å raskt generere store homolog rekombinasjon vektorer.
Den videre utviklingen av teknikker for rask, storskala manipulering av endogene genloci vil utvide bruken av Drosophila melanogaster som en genetisk modell organisme for human-sykdom forskning. De siste årene har tekniske fremskritt som homolog rekombinasjon og recombineering. Men generere entydige null mutasjoner eller tagging endogene proteiner fortsatt en betydelig innsats for de fleste gener. Her beskriver vi og demonstrerer teknikker for bruk av recombineering-baserte metoder for kloning for å generere vektorer som kan brukes for å målrette og manipulere endogene loci in vivo Konkret er det etablert en kombinasjon av tre forhold: (1). BAC transgenesis / recombineering, ( 2) ender ut homolog rekombinasjon og (3) Gateway teknologi for å gi en robust, effektiv og fleksibel metode for å manipulere endogene genomisk loci. I denne protokollen, gir vi trinn-for-trinn detaljer om hvordan du (1) utforming individual vektorer, (2) hvordan å klone store fragmenter av genomisk DNA inn i homolog rekombinasjon vektor ved hjelp av gap reparasjon, og (3) hvordan å erstatte eller merke gener av interesse innenfor disse vektorer ved hjelp av en ny runde med recombineering. Til slutt vil vi også gi en protokoll for hvordan å mobilisere disse kassetter in vivo for å generere en knockout, eller en merket genet via knock-in. Disse metodene kan lett bli vedtatt for flere mål i parallell og gi et middel for å manipulere Drosophila genomet på en riktig og effektiv måte.
Rengjør molekylært-definerte manipulasjoner av single gener på deres endogene loci tilby et uvurderlig verktøy for å studere et mylder av spørsmål som er relevante for eukaryote biologi. Reversere Drosophila genetiske teknikker for å generere tap-av-funksjon alleler hadde vist seg å være utfordrende til Golić og kolleger introdusert i vivo gene targeting bruke homolog rekombinasjon til Drosophila 1-3. De viste at bestemte genomiske loci kan man ved å bruke et lineært fragment av DNA fra et integrert transgen konstrukt. Denne lineære "donor" DNA er generert in vivo ved FRT-mediert rekombinasjon (å skjære DNA fra kromosomet som et sirkulært molekyl) etterfulgt av linearisering med meganuclease I-SCEI. Selv om denne metoden har blitt brukt til å generere et antall definerte lesjoner, har teknikken ikke vært lett skalerbar for manipulering av mange gener i parallell fordi hvert enkeltdual knockout konstruere krever tydelig og tilpasset design. For eksempel, vanskeligheter sømløst manipulere store fragmenter av DNA (> 5 kb) in vitro ved bruk av klassisk restriksjonsenzym / ligering kloning eller PCR, samt størrelse begrensninger på tradisjonell in vivo transformasjon vektorer ofte i konflikt med rask etablering av homolog rekombinasjon målretting vektorer. For å overvinne disse begrensninger kombinerte vi den recombineering / transgenesis P [ACMAN]-system, som tillater den sub-kloning og transgenesis på opptil 100 kb av DNA, med endene ut-genet targeting metode for å etablere en effektiv og relativ rask plattformen forenkler Drosophila gene targeting.
Rekombinasjon-mediert genteknologi (recombineering) er en kraftig homolog rekombinasjon-baserte kloning teknologi 4,5. I motsetning til konvensjonelle restriksjonsenzym / ligase kloning, er recombineering ikke begrenset av sekvensen eller size av den manipulerte DNA. Recombineering bruker en spesiell E. coli stamme som havner rekombinasjon maskiner levert av en defekt λ prophage fire. Denne teknikken har nylig blitt tatt i bruk i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila er avhengig av en modifisert betinget amplifibart bakteriell kunstig kromosom (BAC) vektor kalt P [ACMAN] 6,7. Dette vektor bærer to opprinnelsen til replikering: OriV, som produserer high-kopi nummer etter kjemisk induksjon for rensing av store mengder DNA som kreves for sekvensering og embryo injeksjon og åpninger, som opprettholder lav-kopi nummer under basale forhold. I tillegg, P [ACMAN] vektor er utstyrt med en bakteriell tilknytningssted (attB) område. Den attB området fungerer som et substrat for ΦC31 integrase-mediert transgenesis som gjør at inkorporering av store DNA-fragmenter til en forhåndsbestemt landingssted i Drosophila genom 8,9.
Vi har generert en P [ACMAN] vektor (referert til som P [ACMAN]-KO 1,0) som kan bli brukt som en målsøkende vektor for-ender ut homolog rekombinasjon 10,11. Å innlemme ender ut gene targeting teknologi inn i systemet, la vi to FRT og to I-SCEI nettsteder. Vi har også inkludert en Gateway kassett innenfor denne modifiserte vektor for å effektivisere prosessen med å innlemme de homologidomene armene i P [ACMAN]-KO 1.0. Dette gir en hurtig og enkel måte å innføre praktisk talt en hvilken som helst genomisk region av interesse i målrettingsverdien vektor. I denne protokollen vil vi beskrive hvordan du ingeniør en målretting vektor ved hjelp av P [ACMAN]-KO 1.0, og hvordan å mobilisere denne vektor in vivo å målrette den endogene locus. For formålet med denne protokollen vil vi bruke RFP / Kan kassett som erstatter et gen av interesse, men en rekke kassetter som inneholder et antibiotikum seleksjonsmarkør kan brukes med denne protokoll. Vi har designet og hell brukt et sett med kassetter forgenet utskifting og tagging 10,11.
Kraften av genetiske modellorganismer i biomedisinsk forskning er i stor grad basert på de verktøyene som er tilgjengelige for genetisk manipulasjon. De små modeller C. elegans og Drosophila spesielt tillate for billig og rask molekylærgenetiske analyser av komplette stier og genet familier innblandet i flercellede utvikling eller funksjon. Siste årene har sett betydelige fremskritt innen verktøy utvikling for å manipulere gener i Drosophila 14,15. For eksempel ble recombinee…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Hugo Bellen og Bloomington Stock Center for reagenser. Vi videre takke Koen Venken, Hugo Bellen og alle medlemmer av Buszczak og Hiesinger laboratorier for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) og MB (RO1GM086647), et stipend ved Cancer Prevention Research Institute of Texas til MB og PRH (RP100516), og Welch Foundation (I-1657) til PRH. MB er en EE og Greer Garson Fogelson Scholar i biomedisinsk forskning og PRH er en Eugene McDermott Scholar i biomedisinsk forskning ved UT Southwestern Medical Center.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |