Recombineering Construções recombinação homóloga em<em> Drosophila</em
Summary
Técnicas de recombinação homóloga avançar muito<em> Drosophila</em> Genética, permitindo a criação de mutações molecularmente precisas. A recente adopção recombineering permite manipular grandes pedaços de DNA e transformá-los em<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. Os métodos aqui apresentados combinar estas técnicas para gerar rapidamente grandes vectores de recombinação homóloga.
Abstract
A continuação do desenvolvimento de técnicas para a manipulação rápida e em grande escala de loci de genes endógenos vai alargar a utilização de Drosophila melanogaster como um organismo modelo genético para investigação relacionada com a doença humana-. Nos últimos anos houve avanços técnicos e recombineering como recombinação homóloga. No entanto, a geração de mutações nulas inequívocos ou proteínas endógenas marcação continua a ser um esforço substancial para a maioria dos genes. Aqui, nós descrevemos e demonstrar as técnicas para a utilização de métodos de clonagem baseados em recombineering para gerar vectores que podem ser utilizados para alvejar e manipular loci endógenas in vivo Especificamente, nós estabelecemos uma combinação de três tecnologias: (1). BAC transgénese / recombineering, ( 2) termina-a recombinação homóloga e (3) de tecnologia de gateway para fornecer um método robusto, flexível e eficiente para a manipulação de loci genómicas endógenos. Neste protocolo, nós fornecemos detalhes passo-a-passo sobre como (1) projeto individuavetores l, (2) como clonar grandes fragmentos de DNA genômico no vetor recombinação homóloga utilizando reparação lacuna, e (3) como substituir ou marcar genes de interesse dentro desses vetores usando uma segunda rodada de recombineering. Finalmente, vamos também fornecer um protocolo de como mobilizar esses cassetes in vivo para gerar um nocaute ou um gene marcado via knock-in. Estes métodos podem ser facilmente adotado para alvos múltiplos em paralelo e fornecer meios para manipular o genoma de Drosophila em uma maneira oportuna e eficiente.
Introduction
Limpe manipulações molecularmente definidos de genes individuais em seus loci endógenos oferecer uma ferramenta de valor inestimável para o estudo de uma miríade de questões relevantes para a biologia dos eucariotas. Drosophila reverter técnicas genéticas para a geração de alelos de perda de função tinha provado ser um desafio até Golic e colegas introduziram em segmentação de genes in vivo utilizando recombinação homóloga de Drosophila 1-3. Eles demonstraram que o locus genómico específicos podem ser alvo utilizando um fragmento linear de ADN a partir de uma construção transgénica integrado. Este DNA linear "dador" é gerado in vivo por meio de recombinação FRT-mediada (para excisar o ADN do cromossoma como uma molécula circular), seguido por linearização com a meganuclease I-Scel. Embora esta metodologia tem sido utilizada com sucesso para gerar uma variedade de lesões definidos, a técnica não tem sido facilmente adaptar para a manipulação de vários genes em paralelo, porque cada indivíduoconstrução dupla de nocaute requer design distinto e personalizado. Por exemplo, as dificuldades em manipular facilmente grandes fragmentos de ADN (> 5 kb) in vitro, usando a enzima de restrição clássica / ligadura clonagem ou PCR, bem como as limitações de tamanho da tradicional, em vectores de transformação in vivo, interferem frequentemente com a criação rápida de recombinação homóloga segmentação vetores. Para superar essas limitações, nós combinamos a P [acman] sistema recombineering / transgenia, que permite a sub-clonagem e transgênese de até 100 kb de DNA, com o fim-out gene metodologia visando a estabelecer uma plataforma eficiente e relativamente rápida que facilita gene Drosophila segmentação.
Recombinação mediada por engenharia genética (recombineering) é um poderoso recombinação homóloga baseada em tecnologia de clonagem 4,5. Em contraste com a enzima / ligase de clonagem convencional restrição, recombineering não é limitado pela sequência ou size do DNA manipulado. Recombineering utiliza uma E. especial coli que alberga maquinaria de recombinação é fornecida por um profago defeituoso λ 4. Esta técnica foi recentemente aprovada para uso em Drosophila 6,7. Recombineering em Drosophila depende de um cromossoma alterado condicionalmente amplificável bacteriano artificial (BAC) vetor chamado P [acman] 6,7. Este vector transporta duas origens de replicação: oriV, que produz maior número de cópia por indução química, para a purificação de grandes quantidades de ADN necessárias para a sequenciação e injecção de embriões e oris, que mantém baixo número de cópia em condições basais. Além disso, o P [acman] vector é equipado com um acessório local bacteriana (attB). O local attB serve como um substrato para a integrase ΦC31 transgénese mediada que permite a incorporação de grandes fragmentos de ADN num local de pouso predeterminado dentro do genoma de Drosophila 8,9.
Geramos um P [acman] vetor (referido como P [acman]-KO 1.0) que pode ser usado como um vector-alvo termina para fora recombinação homóloga 10,11. Para incorporar fins-out gene targeting tecnologia no sistema, nós adicionamos dois FRT e dois locais I-SCEI. Incluímos também uma cassete gateway dentro desse vetor modificado para agilizar o processo de incorporação dos braços de homologia em P [acman]-KO 1.0. Isso fornece uma maneira rápida e simples para introduzir praticamente qualquer região genômica de interesse no vetor alvo. Neste protocolo, irá descrever como projetar um vetor alvo usando P [acman]-KO 1.0, e como mobilizar esse vetor in vivo para atingir o locus endógeno. Para o propósito deste protocolo usaremos o cassete RFP / Kan para substituir um gene de interesse, mas uma variedade de cassetes que contêm um marcador de selecção de antibiótico pode ser usada com este protocolo. Temos desenvolvido e utilizado com sucesso um conjunto de cassetes parasubstituição de genes de marcação e 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
O poder de organismos modelo genético em pesquisa biomédica é em grande parte baseado nas ferramentas disponíveis para a manipulação genética. Os modelos pequenos C. elegans e Drosophila em particular, permitir análises genéticas moleculares barato e rápido de caminhos completos e famílias de genes implicados no desenvolvimento multicelular ou função. Nos últimos anos houve avanços significativos no desenvolvimento de ferramentas para manipulação de genes em Drosophila 14…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Banco de Bloomington Centro de reagentes e Hugo Bellen. Agradecemos mais Koen Venken, Hugo Bellen e todos os membros da Buszczak e Hiesinger laboratórios para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Saúde para ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) e MB (RO1GM086647), a concessão pelo Cancer Prevention Research Institute of Texas a MB e PRH (RP100516), eo Welch Fundação (I-1657) para PRH. MB é um EE e Greer Garson Fogelson Scholar em Investigação Biomédica e PRH é um Eugene McDermott Scholar em Investigação Biomédica pelo UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
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