Recombineering Гомологичная рекомбинантные конструкции в<em> Drosophila</em
Summary
Гомологичной рекомбинации методы в значительной степени улучшить<em> Drosophila</em> Генетика позволяет создавать молекулярной точностью мутаций. Недавнее принятие recombineering позволяет манипулировать большими участками ДНК и трансформировать их в<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. Методы, представленные здесь сочетать эти методы, чтобы быстро генерировать большие векторов для гомологичной рекомбинации.
Abstract
Продолжение разработки методов для быстрого, крупномасштабные манипуляции эндогенных генных локусов расширит использование дрозофилы как генетическая модель для организма человека заболеваниям соответствующих исследований. В последние годы наблюдается технических достижений, как гомологичной рекомбинации и recombineering. Тем не менее, однозначного генерации мутаций нулевым или эндогенных белков пометки остаются значительные усилия для большинства генов. Здесь описывают и демонстрируют методы использования recombineering методы, основанные на клонирование для генерации векторов, которые можно использовать для выявления и манипулировать эндогенных локусов в естественных В частности, мы установили комбинацию трех технологий: (1). BAC трансгенез / recombineering ( 2) выезда концах гомологичной рекомбинации и (3) Шлюз технологии для обеспечения надежной, эффективной и гибкий метод для манипулирования эндогенных локусов генома. В этом протоколе, мы предоставляем шаг за шагом, подробно о том, как (1) Дизайн индивидовL векторов, (2), как клонировать больших фрагментов геномной ДНК в векторе гомологичной рекомбинации использованием разрыв ремонта, и (3), как заменить или тег интерес гены внутри этих векторов с использованием второго раунда recombineering. Наконец, мы также обеспечим протокол о том, как мобилизовать эти кассеты в естественных условиях для создания нокаут, либо помеченный ген через нок-ин. Эти методы могут быть легко принята для нескольких целей параллельно и обеспечивают средства для работы генома Drosophila своевременным и эффективным образом.
Introduction
Очистите молекулярно определенные манипуляции отдельных генов на их эндогенных локусов служат бесценным инструментом для изучения множество вопросов, связанных с эукариотической биологии. Drosophila обратном генетические методы для генерации потерей функции аллелей оказалось весьма сложным, пока Голик и его коллеги не введены в генного таргетинга естественных условиях с использованием гомологичной рекомбинации Drosophila 1-3. Они продемонстрировали, что специфичные локусы генома могут быть направлены с использованием линейного фрагмента ДНК из интегрированной конструкции трансгенных. Этот линейный "донора" ДНК генерируется в естественных условиях через FRT-опосредованной рекомбинации (акцизными ДНК из хромосомы в виде кольцевой молекулы) с последующей линеаризации с meganuclease I-SceI. Хотя эта методика была успешно использована для получения различных определено поражений, методика не было легко масштабируемым для манипулирования многочисленных генов параллельно, поскольку каждый индивидуальноеДвойная конструкция нокаутом требует четкой и индивидуальный дизайн. Например, трудности с плавно манипулирования крупных фрагментов ДНК (> 5 кб) в пробирке с использованием классических рестриктазы / лигирование клонирования или ПЦР, а также размер ограничения традиционных в естественных векторов преобразования часто мешает быстрого создания нацеливание гомологичной рекомбинации векторов. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы объединили recombineering / трансгенез P [Acman] система, которая позволяет суб-клонирования и трансгенез до 100 кб ДНК, концы выезда генного таргетинга методологии для создания эффективной и сравнительно быстрого платформу, которая облегчает Drosophila генного таргетинга.
Рекомбинация-опосредованной генной инженерии (recombineering) является мощным гомологичной рекомбинации на основе технологии клонирования 4,5. В отличие от обычных рестриктазы / лигазы клонирование, recombineering не ограничено последовательностью или СИЗе манипулировать ДНК. Recombineering использует специальный E. Штамм, что таит в рекомбинации механизмов, предусмотренных дефектным λ профаге 4. Этот метод в последнее время были приняты для использования в Drosophila 6,7. Recombineering у дрозофилы опирается на изменение условно амплифицируемым бактериальные искусственные хромосомы (BAC) называется вектором P [Acman] 6,7. Этот вектор несет в себе два начала репликации: Орив, который производит высокого числа копий на химическую индукцию для очистки больших количеств ДНК, необходимыми для секвенирования и эмбрион инъекций и Oris, который поддерживает низким числом копий в базальных условиях. Кроме того, P [Acman] вектор оснащен прикрепление бактерий (ATTB) сайта. Сайт ATTB служит в качестве субстрата для ΦC31 интегразы-опосредованного трансгенеза, который позволяет включение больших фрагментов ДНК в заданном месте посадки в геноме дрозофилы 8,9.
Мы генерируются P [Acman] вектор (называемый P [Acman]-KO 1,0), который может быть использован в качестве вектора направленного на концах выезда гомологичной рекомбинации 10,11. Чтобы включить концы выезда генного таргетинга технологии в системе, мы добавили две FRT и два I-SceI сайтов. Мы также включили кассету шлюза в этом изменение вектора, чтобы упростить процесс включения гомологии оружия в P [Acman]-KO 1.0. Это обеспечивает быстрый и простой способ ввести практически любой геномной области, представляющей интерес в ориентации вектора. В этом протоколе мы опишем, как спроектировать ориентации вектора с использованием P [Acman] 1,0-KO, и как мобилизовать этот вектор в естественных условиях целевой эндогенный локус. Для целей настоящего Протокола мы будем использовать RFP / Кан кассеты заменить интересующего гена, но нескольких кассет, которые содержат антибиотик селективный маркер может быть использован с настоящим Протоколом. Мы разработали и успешно использовали набор кассетзамены гена и пометки 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сила генетических модельных организмов в биомедицинских исследованиях в значительной степени основана на инструменты для генетических манипуляций. Маленькие модели C. Элеганс дрозофилы и, в частности, позволяют недорогой и быстрой молекулярно-генетических анализов полной путе?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Уго Bellen и Центр Блумингтон фондовую реагентов. Мы также благодарим Коэн Venken, Хьюго Bellen и все члены Buszczak и Hiesinger лаборатории за полезные обсуждения. Работа выполнена при поддержке грантов от Национального института здравоохранения ACR (T32GM083831), ВНР (RO1EY018884) и MB (RO1GM086647), грант по профилактике рака научно-исследовательского института в Техасе Мб и ВНР (RP100516) и Welch Foundation (I-1657), чтобы PRH. МБ EE и Грир Гарсон Фогельсона Scholar в биомедицинских исследованиях и PRH является выпускником школы Евгения McDermott в биомедицинских исследованиях в Техасском медицинском центре.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Génétique. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Génétique. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
