Recombinería homólogos Construcciones recombinación en<em> Drosophila</em
Summary
Técnicas de recombinación homóloga en gran medida avanzar<em> Drosophila</em> Genética al permitir la creación de mutaciones molecularmente precisas. La reciente adopción de recombineering permite para manipular grandes trozos de ADN y transformarlos en<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. Los métodos presentados aquí combinar estas técnicas para generar rápidamente grandes vectores de recombinación homóloga.
Abstract
El continuo desarrollo de técnicas para la manipulación rápida, a gran escala de genes endógenos loci ampliará el uso de Drosophila melanogaster como organismo modelo genético para la investigación relacionada con la enfermedad humana. Los últimos años han visto avances técnicos como la recombinación homóloga y recombineering. Sin embargo, la generación de mutaciones nulas inequívocos o proteínas endógenos de etiquetado sigue siendo un esfuerzo sustancial para la mayoría de los genes. A continuación, describimos y demostrar las técnicas para el uso de métodos de clonación basados en recombinería para generar vectores que se pueden utilizar para apuntar y para manipular los loci endógenos in vivo Específicamente, hemos establecido una combinación de tres tecnologías:. (1) BAC transgénesis / recombinería, ( 2) extremos-a cabo la recombinación homóloga y (3) la tecnología de puerta de enlace para proporcionar un método robusto, eficaz y flexible para la manipulación de los loci genómicos endógenos. En este protocolo, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre la forma de (1) el diseño individuaVectores l, (2) cómo clonar grandes fragmentos de ADN genómico en el vector de recombinación homóloga con reparación brecha, y (3) la forma de reemplazar o etiquetar genes de interés dentro de estos vectores con una segunda ronda de recombineering. Por último, también vamos a proporcionar un protocolo de cómo movilizar estos cassettes in vivo para generar un golpe de gracia, o un gen marcado por knock-in. Estos métodos se pueden adoptar fácilmente para múltiples objetivos en paralelo y proporcionan un medio para manipular el genoma de Drosophila en una manera oportuna y eficiente.
Introduction
Limpie manipulaciones molecularmente definidas de genes individuales en los loci endógenos ofrecen una valiosa herramienta para estudiar una gran variedad de cuestiones relacionadas con la biología eucariótica. Drosophila técnicas de genética inversa para generar alelos de pérdida de función había demostrado ser un reto hasta Golic y sus colegas introdujeron en génica in vivo focalización utilizando recombinación homóloga para Drosophila 1-3. Ellos demostraron que los loci genómicos específicas podrían seleccionarse utilizando un fragmento lineal de ADN a partir de un constructo transgénico integrado. Este ADN "donante" lineal se genera en vivo a través de recombinación FRT-mediada (para escindir el ADN del cromosoma como una molécula circular) seguido por linealización con la meganucleasa I-SCE. Aunque esta metodología se ha utilizado con éxito para generar una variedad de lesiones definidas, la técnica no ha sido fácilmente escalable para la manipulación de numerosos genes en paralelo, ya que cada indiviconstrucción de doble knockout requiere un diseño distinto y personalizado. Por ejemplo, las dificultades en la manipulación sin problemas grandes fragmentos de ADN (> 5 kb) in vitro utilizando enzima clásica restricción / ligadura de la clonación o la PCR, así como las limitaciones de tamaño de tradicional en vectores de transformación in vivo a menudo interfieren con la rápida creación de recombinación homóloga focalización vectores. Para superar estas limitaciones, hemos combinado el sistema recombineering P / transgénesis [ACMAN], que permite la sub-clonación y transgénesis de hasta 100 kb de ADN, con los extremos de salida génico metodología para establecer una plataforma eficiente y relativamente rápida que facilita la orientación del gen de Drosophila.
Recombinación mediada por ingeniería genética (recombinería) es un potente recombinación homóloga basada en la tecnología de clonación 4,5. En contraste con enzima / ligasa clonación restricción convencional, recombinería no está limitado por la secuencia o SIZe de la ADN manipulado. Recombinería utiliza un E. especial cepa de E. coli que alberga maquinaria de recombinación proporcionada por un profago λ defectuoso 4. Esta técnica se ha aprobado recientemente para el uso en Drosophila 6,7. Recombinería en Drosophila se basa en un cromosoma modificado condicionalmente amplifiable artificial bacteriano (BAC) vector llamado P [ACMAN] 6,7. Este vector lleva dos orígenes de replicación: OriV, lo que produce alto número de copias tras la inducción química para la purificación de grandes cantidades de ADN necesarias para la secuenciación y la inyección embrión y oris, que mantiene bajo número de copias bajo condiciones basales. Además, el P [ACMAN] vectorial está equipado con un sitio de unión bacteriano (attB). El sitio attB sirve como un sustrato para C31 transgénesis mediada por integrasa que permite la incorporación de grandes fragmentos de ADN en un sitio de aterrizaje predeterminada dentro del genoma de Drosophila 8,9.
Hemos generado un P [ACMAN] vectorial (referido como P [ACMAN]-KO 1.0) que puede ser usado como vector de abordaje para termina-a cabo la recombinación homóloga 10,11. Incorporar extremos Salida génico tecnología en el sistema, hemos añadido dos sitios FRT y dos I-SCEI. También hemos incluido un casete de puerta de enlace dentro de este vector modificado para agilizar el proceso de incorporación de los brazos de homología en P [ACMAN]-KO 1.0. Esto proporciona una manera rápida y sencilla para introducir prácticamente cualquier región genómica de interés en el vector de abordaje. En este protocolo vamos a describir cómo diseñar un vector de orientación utilizando P [ACMAN]-KO 1.0, y cómo movilizar este vector in vivo para apuntar el locus endógeno. A los efectos del presente Protocolo se utilizará el cartucho RFP / Kan para reemplazar un gen de interés, sino una variedad de cassettes que contienen un marcador de selección de antibióticos se pueden utilizar con este protocolo. Hemos diseñado y utilizado con éxito una serie de casetes desustitución de genes y marcado de 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
El poder de los organismos modelos genéticos en la investigación biomédica se basa en gran medida de las herramientas disponibles para la manipulación genética. Los modelos pequeños C. elegans y Drosophila, en particular, permiten a los análisis genéticos moleculares de bajo costo y rápida de las rutas completas y familias de genes implicados en el desarrollo o función multicelular. Los últimos años han visto avances significativos en el desarrollo de herramientas para la manipulación de g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Hugo Bellen y la Bolsa Center Bloomington para los reactivos. Más Agradecemos Koen Venken, Hugo Bellen y todos los miembros de los laboratorios Buszczak y Hiesinger útil para los debates. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud de ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) y MB (RO1GM086647), una subvención por el Instituto de Investigación de la Prevención del Cáncer de Texas a MB y PRH (RP100516), y el Welch Fundación (I-1657) a PRH. MB es una EE y Greer Garson Fogelson Académico en Investigación Biomédica y PRH es un erudito Eugene McDermott en Investigación Biomédica de UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
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