Recombineering homolog rekombination Konstruktionerna i<em> Drosophila</em
Summary
Homolog rekombination tekniker avancera kraftigt<em> Drosophila</em> Genetik genom att möjliggöra skapandet av molekylärt exakta mutationer. Den nyligen antagna recombineering gör att man kan manipulera stora bitar av DNA och omvandla dem till<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. De metoder som presenteras här kombinera dessa tekniker att snabbt generera stora homologa rekombinationsvektorer.
Abstract
Den fortsatta utvecklingen av tekniker för snabb, storskalig manipulering av endogena genloci kommer att bredda användningen av Drosophila melanogaster som en genetisk modell organism för human-sjukdom relaterad forskning. De senaste åren har tekniska framsteg som homolog rekombination och recombineering. Dock genererar entydiga null mutationer eller tagga proteiner endogena fortfarande en betydande insats för de flesta gener. Här beskriver vi och demonstrera tekniker för att använda recombineering-baserade kloning metoder för att generera vektorer som kan användas för att rikta och manipulera endogena loci in vivo Specifikt har vi etablerat en kombination av tre tekniker:. (1) BAC transgenes / recombineering, ( 2) ändar ut homolog rekombination och (3) Gateway teknik för att ge en robust, effektiv och flexibel metod för att manipulera endogena genomiska loci. I detta protokoll, ger vi steg-för-steg-information om hur du (1) utformning individual vektorer, (2) hur man klona stora fragment av genomisk DNA i homolog rekombination vektor gap-reparation, och (3) hur man kan ersätta eller tagga gener av intresse inom dessa vektorer med hjälp av en andra omgång av recombineering. Slutligen ger vi också ett protokoll för hur man kan utnyttja dessa kassetter in vivo för att generera en knockout, eller en taggad gen via knock-in. Dessa metoder kan lätt anpassas till flera mål parallellt och ger ett medel för att manipulera Drosophila genomet i ett snabbt och effektivt sätt.
Introduction
Rengör molekylärt definierade manipulationer av enstaka gener hos deras endogena loci erbjuder ett ovärderligt verktyg för att studera en myriad av frågor av betydelse för eukaryot biologi. Drosophila omvända genetiska tekniker för att generera förlust av funktion alleler hade visat sig vara utmanande tills Golic och kollegor infördes vivo genmålsökning använder homolog rekombination till Drosophila 1-3. De visade att specifika genomiska loci kan riktas med hjälp av ett linjärt fragment av DNA från en integrerad transgen konstruktion. Denna linjära "donator" DNA genereras in vivo genom FRT-medierad rekombination (för att skära ut DNA från kromosomen som en cirkulär molekyl) följt av linearisering med meganuclease I-SCEI. Även om denna metod har använts för att generera ett antal olika definierade lesioner har tekniken inte varit lätt skalbara för manipulering av ett stort antal gener parallellt, eftersom varje enskilddubbla knockoutkonstruktet kräver distinkt och egen design. Till exempel, svårigheter att sömlöst manipulera stora fragment av DNA (> 5 kb) in vitro med användning av klassisk restriktionsenzym / lige kloning eller PCR, samt de begränsningar storleken av traditionell in vivo transformationsvektorer stör ofta med att snabbt skapa homolog rekombination inriktning vektorer. För att övervinna dessa begränsningar, kombinerat vi recombineering / transgenes P [acman] systemet, vilket gör att sub-kloning och genmodifiering av upp till 100 kb av DNA, med ändarna ut genmålinriktning metodik för att skapa en effektiv och relativt snabb plattform som underlättar Drosophila genmålsökning.
Rekombination-medierad genetisk ingenjörskonst (recombineering) är en kraftfull homolog rekombination-baserad kloning teknik 4,5. I motsats till konventionell restriktionsenzym / ligas kloning, är recombineering inte begränsad av en gensekvens eller size av manipulerade DNA. Recombineering använder en speciell E. coli-stam som härbärgerar rekombination maskiner från en defekt λ profag 4. Denna teknik har nyligen antagits för användning i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila bygger på en modifierad villkorligt amplifierbar bakteriell artificiell kromosom (BAC) vektor kallas P [acman] 6,7. Denna vektor bär två replikationsursprung: oriV, som producerar högt-kopietal vid kemisk induktion för rening av stora mängder av DNA som krävs för sekvensering och embryo injektionen och oris, som upprätthåller låg-kopietal enligt basala förhållanden. Dessutom P [acman] vektor är utrustad med en bakteriell infästning (attB)-ställe. Den attB-ställe fungerar som ett substrat för ΦC31 integras-förmedlad transgenes som tillåter inkorporering av stora DNA-fragment till en förutbestämd landningsplats inom Drosophila genomet 8,9.
Vi har genererat en P [acman] vektor (kallat P [acman]-KO 1.0) som kan användas som en målsökande vektor för slutar-out homolog rekombination 10,11. Att införliva ändar ut genmålinriktning teknik i systemet, har vi lagt två FRT och två I-SCEI webbplatser. Vi har även inkluderat en Gateway kassett inom denna modifierade vektor för att effektivisera processen för att införliva homologiarmarna i P [acman]-KO 1.0. Detta ger ett snabbt och enkelt sätt att införa praktiskt taget vilken genomisk region av intresse i den målsökande vektorn. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur man kan konstruera en målsökande vektor med P [acman]-KO 1.0, och hur man kan utnyttja denna vektor in vivo för att rikta den endogena lokus. För detta protokoll kommer vi att använda RFP / Kan kassett för att ersätta en gen av intresse, men en mängd olika kassetter som innehåller ett antibiotikum selektionsmarkör kan användas med detta protokoll. Vi har designat och framgångsrikt använt en uppsättning kassetter förgenersättning och taggning 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kraften av genetiska modellorganismer inom biomedicinsk forskning i stor utsträckning bygger på de verktyg som finns för genetisk manipulation. De små modellerna C. elegans och Drosophila framför allt möjliggöra billiga och snabba molekylärgenetiska analyser av kompletta banor och familjer gen inblandad i flercellulär utveckling eller funktion. De senaste åren har sett betydande framsteg i utvecklingen av verktyg för att manipulera gener i Drosophila 14,15. Till exempel v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Hugo Bellen och Bloomington Stock Centrum för reagenser. Vi tackar ytterligare Koen Venken, Hugo Bellen och alla medlemmar i Buszczak och Hiesinger labb för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) och MB (RO1GM086647), ett bidrag från Cancer Prevention Research Institute of Texas till MB och PRH (RP100516), och Welch Foundation (I-1657) till PRH. MB är en EE och Greer Garson Fogelson Scholar i biomedicinsk forskning och PRH är en Eugene McDermott Scholar i biomedicinsk forskning vid UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Génétique. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Génétique. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
