A Novel<em> Ex vivo</em> Kultur Metod för embryonala Mouse Heart
Summary
Utvecklingsstudier på mus hämmas av otillgänglighet av embryot under dräktigheten. Att främja långsiktig odling av embryonala hjärtat vid sena stadier av dräktigheten, utvecklade vi ett protokoll där det utskurna hjärtat odlas i ett halvfast, utspädd Matrigel.
Abstract
Utvecklingsstudier på mus hämmas av otillgänglighet av embryot under dräktigheten. Således, för protokoll isolera och kultur enskilda organ av intresse är viktigt att ge en metod för både visualisera förändringar i utvecklingen och möjliggöra strategier nya behandlingsstrategier. Att främja långsiktig odling av embryonala hjärtat vid sena stadier av dräktigheten, utvecklade vi ett protokoll där det utskurna hjärtat odlas i ett halvfast, utspädd Matrigel. Detta substrat ger tillräckligt stöd för att bibehålla den tredimensionella strukturen men är flexibel nog att tillåta fortsatt kontraktion. I korthet, är hjärtan skars ut från embryot och placerades i en blandning av kall Matrigel utspädd 1:1 med tillväxtmedium. Efter den utspädda Matrigel stelnar, är tillväxt medium till kulturen skålen. Hjärtan utskurna så sent som embryonala dag 16,5 var lönsamt för fyra dagar efter dissekering. Analys av koronar plexus visar att denna metod intestöra koronar vaskulär utveckling. Således presenterar vi en ny metod för långsiktig odling av embryonala hjärtan.
Introduction
Under de senaste åren har den transgena musen varit den dominerande modellen för att studera defekter utveckling hjärta. Däremot har andra modellorganismer såsom zebrafisk, visat sig ha betydande fördelar jämfört med musen. Tre stora fördelar med zebrafisk är externa utläggning av ägg, för enkel åtkomst till de embryon, den optisk transparens av embryona, som möjliggör enkel visualisering av hjärt-utveckling, och lättheten att applicera små molekylära behandlingar för att modulera utvecklingen av embryot ett. Sålunda skulle utvecklingen av en kultur teknik som tillät tillväxt ex utero av en embryonal orgel förbi, åtminstone delvis, de begränsningar som för närvarande upplevs av forskare som studerar utvecklingsprocesser hos transgena möss.
Ex vivo hjärt kultur har utvecklats i både brud och musembryo som tillåter behandling med små molekyler och analys av hur DIFka regioner i hjärtat kommunicera 2-6. För hela mushjärta kultur, hjärtan tas från embryon upp till embryonala (E) kan 12,5 av ålder placeras i odlingsmedium med eller utan gungande 2,3,5. Med denna teknik har embryonala hjärtan framgångsrikt inkuberas för att likvärdigheten av E13.5, och hjärtan odlade med gungande har upprätthållits så länge som tre dagar (med början vid E10.5) 3. Dock har inga studier rapporterade framgångsrik kultur av hjärtan från äldre embryon. Likaså har räddnings experiment varit begränsade till att tillämpa det terapeutiska medlet globalt till odlingsmediet 2.
En bit kultur-system, där hjärtan skärs, inbäddade, och snittades med en vibratome, har också använts för både yngre hjärtan, såsom E12.5 mus hjärtan och Hamburger-Hamilton steg 36 (cirka E16 i mus) chick hjärtan 2,4,6 och äldre hjärtan, såsom postnatal och vuxen mus hearts och vuxna människors hjärtan 7,8. Medan de embryonala analyserna har typiskt utnyttjat 150-ìm tjocka sektioner 2,4, kan snittjocklek vara en stor som 500 nm utan tecken på syrebrist 8. Dessa slice kulturer har upprätthållas så länge som två månader i kultur, med de flesta skivor upprätthålla kontraktilitet under hela denna period 9. Jämfört med studier i isolerade hjärtmuskelceller, dessa slice kulturer tillåter samodling av hjärtmuskelceller med sina grannländer celltyper och ger en användbar metod för ex vivo analys. Emellertid dessa kulturer kräver mer genomarbetade ställt upp än att helt enkelt placera ett hjärta i odlingsmedium (t.ex. inbäddning av levande hjärta för sektionering på en vibratom), och någon analys är naturligtvis begränsad till den del av hjärtat inom sektionen.
Med tanke på de begränsningar som beskrivits ovan för odling embryonala mus hjärtan och den rikedom av transgena möss available för studien, utvecklade vi en ex vivo mussystem hjärta kultur liknar en ex vivo lung kultur som utvecklats av Weaver, tillåter et al. 10 Vår kultur systemet långsiktigt kultur och visualisering av ombyggnad kranskärlscirkulation inom hela embryonala mus hjärtan. Dessutom tillåter användning av Matrigel pärlor att hållas på plats nära hjärtat, vilket ger en lokaliserad behandling med terapeutiska medel. Dessa experiment kan utföras vid olika utvecklingsstadier tidpunkter för att jämföra effekten av en viss behandling på en process såsom kransartär bildning. Eftersom små molekyler kan diffundera genom Matrigel, kan denna kultur systemet även användas för att kulturen dissekerade regioner i hjärtat nära varandra för att avgöra om specifika cell-cell kontakter är nödvändiga för vissa utvecklingsprocesser eller om parakrina signalering från en region till en annan är nödvändigt.
Detta odlingssystemär relativt enkel och, till skillnad från den bit kultur-systemet, använder sig av grundläggande kultur reagenser och uppställningar som är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. I korthet, är exciderade embryonala hjärtan odlades i utspädd Matrigel, som ger en semi-fast bärare. Detta stöd är tillräckligt för att bibehålla den tredimensionella morfologi av hjärtat samtidigt som den tillåter hjärtat att dra ihop sig. Med detta system kan hela hjärtan från äldre musembryon (E14.5-E16.5) hållas i odling under upp till fyra dagar. Hela koronar plexus bibehålls, till skillnad mot i slice kulturer, så alla signalering ledtrådar som uppstår från olika regioner av hjärtat förbli närvarande. Vidare kan live-cell fluorescerande färgämnen genomsyrar Matrigel att möjliggöra visualisering av levande hjärta, och protein-konjugerade pärlor kan placeras nära hjärtat för att ge en lokaliserad signalering källa. Tillsammans, dessa fördelar gör denna teknik en idealisk metod för att studera utvecklingsprocesser i Embryonenic mushjärta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuvarande kultur-systemet innebär stora fördelar för embryonala studier mushjärta. Denna kultur systemet bevarar myokardkontraktilitet och koronar plexus, med begränsade tecken på nekros, även efter fyra dagar i odling. Vidare ger den halvfasta matrisen tillräckligt stöd för att bibehålla den tredimensionella morfologi utveckla hjärtat samtidigt som flexibiliteten till avtal och även att hålla belagda kulor på plats under kultur. Trots detta stöd, är denna matris permeabel för fluorescerande färg?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Andrea Portbury för kritisk läsning av manuskriptet och NIH (bidrag # R01HL061656) för finansieringsstöd.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. . Cardiac Development. , (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
