कार्यात्मक रूपांकनों और उनके बंधन पार्टनर्स के पेप्टाइड आधारित पहचान
Summary
Exosomes में एचआईवी -1 Nef का स्राव अंतर्निहित तंत्र को काटना तकनीक वर्णित हैं. Nef और प्रोटीन अभिकर्मक से व्युत्पन्न विशिष्ट कम पेप्टाइड्स संरचना, समारोह, और Nef के स्राव संशोधन क्षेत्र के बंधन भागीदारों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे. इन प्रक्रियाओं के कई यंत्रवत अध्ययनों में सामान्य प्रासंगिकता है.
Abstract
हमारे मामले एचआईवी -1 Nef में, पूर्ण लंबाई प्रोटीन में पाए रूपांकनों से व्युत्पन्न विशिष्ट कम पेप्टाइड्स, उनके जैविक समारोह बनाए रखने के लिए, लेकिन यह भी प्रतिस्पर्धात्मक रूप से पूर्ण लंबाई प्रोटीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं न केवल. 20 Nef स्कैनिंग पेप्टाइड्स, प्रत्येक अपने पड़ोसी देश के 10 अमीनो एसिड अतिव्यापी के साथ लंबाई में 20 अमीनो एसिड, का एक सेट apoptosis की इसके शामिल होने के लिए जिम्मेदार Nef में रूपांकनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इन apoptotic रूपांकनों युक्त पेप्टाइड्स पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन को बराबर के स्तर पर apoptosis प्रेरित. Nef का स्राव संशोधन क्षेत्र (SMR) से प्राप्त एक दूसरे पेप्टाइड, exosomes में Nef के स्राव (exNef) में शामिल सेलुलर प्रोटीन के साथ बातचीत करने की क्षमता को बनाए रखा. इस SMRwt पेप्टाइड Nef के SMR मूल भाव को विशेष रूप से बाँध कि सेलुलर प्रोटीन को अलग करने के लिए सह immunoprecipitation प्रयोगों में "चारा" प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रोटीन अभिकर्मक और एंटीबॉडी निषेध शारीरिक रूप से बातचीत की शर्त को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया थासमझना Nef और mortalin, पृथक SMR बाध्यकारी प्रोटीन में से एक, और प्रभाव एक फ्लोरोसेंट आधारित exNef स्राव परख के साथ मापा गया था. SMR मूल भाव है कि बाँध सेलुलर प्रोटीन के लिए पूर्ण लंबाई Nef outcompete करने SMRwt पेप्टाइड की क्षमता, यह exNef स्राव के पहले अवरोध बना. इस प्रकार, पूर्ण लंबाई प्रोटीन में पाए रूपांकनों से व्युत्पन्न विशिष्ट कम पेप्टाइड्स के अद्वितीय गुणों का उपयोग जो यहाँ वर्णित तकनीक, रोजगार से, एक प्रोटीन में कार्यात्मक रूपांकनों की पहचान और रोगजनक कार्यों की पेप्टाइड आधारित अवरोधकों का विकास तेज हो सकती है.
Introduction
एंटी रेट्रोवायरल थेरेपी के आगमन के साथ, पश्चिमी दुनिया में एड्स महामारी धीमा है, लेकिन कटौती नहीं, और एचआईवी के प्रसार को दुनिया भर में एक प्रमुख स्वास्थ्य बोझ होना जारी कर दिया गया है. मामूली प्रभावी RV144 थाई परीक्षण के अपवाद के साथ, एचआईवी टीके अब तक संक्रमण से बचाने के लिए विफलता से पता चला है. इस प्रकार, अतिरिक्त, संभावित चिकित्सीय लक्ष्य में अनुसंधान अभी भी warranted है.
सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण के साथ साथ, लगातार सामान्यीकृत प्रतिरक्षा सक्रियण एचआईवी संक्रमण की एक बानगी है. इस पुरानी प्रतिरक्षा सक्रियण (सीआईए) सेल कारोबार, सक्रिय और भेदभाव लिम्फोसाईटिक subpopulations, सेलुलर थकावट और बुढ़ापा, और सक्रियण प्रेरित कोशिका मृत्यु (AICD) 1,2,3 के माध्यम से टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की हत्या में बढ़ जाती है की ओर जाता है, और यह अच्छी तरह से रोग प्रगति 4,5,6,7,8,9,10,11,12 की मजबूत predictors में से एक के रूप में स्थापित है. हालांकि, तंत्र सीआईए और सीडी 4 अंतर्निहितएचआईवी संक्रमण में कमी टी सेल पूरी तरह से स्पष्ट किया जा रह है.
हमारी प्रयोगशाला और दूसरों से साक्ष्य एचआईवी प्रोटीन Nef (नकारात्मक नियामक फैक्टर) एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं 13,14 से exosomes में अपने स्राव को प्रेरित करता है जिसमें रोग प्रगति के लिए एक मॉडल (चित्रा 1) के लिए हमें का नेतृत्व किया. ये Nef युक्त exosomes (exNef) असंक्रमित सीडी 4 टी कोशिकाओं 15,16 सहित सेल प्रजातियों की संख्या में apoptosis प्रेरित. वैकल्पिक रूप से, monocytes में / मैक्रोफेज exNef बदल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, जैसे साइटोकाइन अभिव्यक्ति, और अनिर्धारित प्रतिरक्षा सक्रियण के एक राज्य को उत्पन्न करने के लिए प्रकट होता है. सबूत के इस शरीर सीआईए और सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण में exNef के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है.
Exosomal तस्करी मार्ग exNef स्राव के इंजीनियरिंग उपन्यास inhibitors में उपयोगी होगा हेरफेर करने Nef की क्षमता अंतर्निहित तंत्र को समझना. ExNef स्राव का निषेध सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण कम हो जाना चाहिएऔर सीआईए ड्राइव एचआईवी / एड्स के रोगजनन कि.
एचआईवी / एड्स रोग प्रगति और इस मॉडल पर बनाया गया है कि बाद के डेटा के लिए हमारे मॉडल के लिए नेतृत्व किया है कि सबूत इकट्ठा करने के लिए, हम हमारे exNef स्राव की आनुवंशिकी का विश्लेषण करने की अनुमति दी है कि उपन्यास अभिकर्मकों और तरीकों की एक संख्या विकसित की है, और यह निर्धारित करने के लिए शुरू सेलुलर प्रोटीन शामिल किया गया. प्रारंभिक काम में, हम Nef प्रोटीन दर्शक कोशिकाओं में apoptosis लाती और Nef ट्रांसफ़ेक्ट और एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं से extracellularly 15 जारी किया गया है कि पाया. एसडीएफ 1α (वैकल्पिक splicing अल्फा के साथ फैक्टर -1 व्युत्पन्न stromal सेल,) से प्राप्त पेप्टाइड्स पहले से ज्यादा पूरी लंबाई अणु 17 के बंधन और संकेत गतिविधि का बनाए रखने के लिए दिखाया गया था. हम Nef के पेप्टाइड्स पूर्ण प्रोटीन की apoptotic गतिविधि के कुछ, और इन पेप्टाइड्स जरूरी Nef apoptotic डोमेन (ओं) होंगे कि बनाए रखने के लिए हो सकता है कि अनुमान लगाया. इन पेप्टाइड्स की पहचान है, और फलस्वरूप Nef लिएapoptotic डोमेन (ओं), हम एनआईएच एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम से 20 एचआईवी -1 Nef स्कैनिंग पेप्टाइड का एक सेट प्राप्त की. इन 20 आ पेप्टाइड्स, अपने पड़ोसी देश के 10 अमीनो एसिड अतिव्यापी प्रत्येक उनके पिछले अमीनो एसिड, यानी N20 फैला Nef अमीनो एसिड 1-20, N30 फैला Nef अमीनो एसिड 11-30, आदि 16 की संख्या से नाम हैं. हम इन कोशिकाओं में पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन प्रेरित apoptosis में दो अलग 10 आ डोमेन अतिव्यापी विशिष्ट पेप्टाइड्स extracellularly टी कोशिकाओं को उजागर पाया. इन Nef व्युत्पन्न apoptotic पेप्टाइड्स के बाद के विश्लेषण के शारीरिक रूप से इन पेप्टाइड्स प्रतिस्पर्धात्मक रूप CXCR4 और अपनी प्राकृतिक ligand के एसडीएफ 1α के बीच बंधन को बाधित करने की अनुमति दी है कि बाध्यकारी कैनेटीक्स के साथ टी कोशिकाओं की सतह पर केमोकाइन रिसेप्टर CXCR4, के साथ बातचीत करने की क्षमता का पता चला. अंत में, CXCR4 के साथ Nef व्युत्पन्न apoptotic पेप्टाइड 'बातचीत apoptosis के लिए अग्रणी इन टी कोशिकाओं में एक तनाव प्रतिक्रिया प्रेरित पाया गया था. यह सबूत हमारे पास quic अनुमतिkly नक्शा Nef के कार्यात्मक डोमेन, ऐसे alanine स्कैनिंग mutagenesis के रूप में मानक डीएनए mutagenic तकनीकों का प्रयोग बहुत लंबे समय लिया होगा कि एक ऐसी प्रक्रिया है. यह भी इन छोटी Nef व्युत्पन्न पेप्टाइड्स पूर्ण लंबाई प्रोटीन में apoptotic डोमेन की जैविक समारोह को बनाए रखा है कि पता चला है.
बाह्य Nef के लिए एक भूमिका की पहचान करने के बाद, टी कोशिकाओं की यानी apoptosis, हम Nef कोशिकाओं से स्रावित था कि कैसे एक बेहतर समझ की मांग की. उत्परिवर्तित Nef निर्माणों की एक श्रृंखला का उपयोग करना, हम एचआईवी Nef दोनों के एन टर्मिनल क्षेत्रों में अत्यधिक संरक्षित Nef प्रोटीन रूपांकनों मैप किया है, और exNef स्राव 13 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि अपने रीसस मकाक बराबर SIV के मैक (बंदर इम्यूनो वायरस) NEF,. इन रूपांकनों की एक, स्राव संशोधन क्षेत्र (SMR, 66VGFPV70) ने अपने पांच अमीनो एसिड के किसी भी या तो बहुत exNef स्राव को कम या समाप्त कर दिया की alanine स्थानापन्न के रूप में, विशेष रूप से महत्वपूर्ण था. सक्रिय आकृति के सी के माध्यम से कोशिकाओं को दिया जबhariot प्रोटीन डिलिवरी अभिकर्मक, एक झंडा पेप्टाइड अनुक्रम (SMRwt) से जुड़ी SMR युक्त पेप्टाइड 18 कोशिकाओं Nef ट्रांसफ़ेक्ट और एचआईवी संक्रमित दोनों से exNef स्राव बाधित पाया गया था. पेप्टाइड्स के साथ हमारे पिछले अनुभव के आधार पर, हम अणु और exNef स्राव में Nef SMR की भूमिका अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए इस पेप्टाइड का उपयोग करने का फैसला किया.
हमारे "चारा प्रोटीन के रूप में" SMRwt पेप्टाइड का उपयोग करना, हम असंक्रमित टी सेल lysates 18 से SMR के सेलुलर बाध्यकारी भागीदारों सह immunoprecipitated. झंडा पेप्टाइड अनुक्रम विरोधी झंडा आत्मीयता राल का उपयोग कर SMRwt पेप्टाइड पर कब्जा करने के लिए एक सुविधाजनक संभाल प्रदान की. SMRwt पेप्टाइड में उत्परिवर्तन alanine के लिए एक एकल वेलिन exNef स्राव के अपने अवरोध को खत्म करने के लिए पर्याप्त था कि हमारे पिछले निष्कर्ष हम SMR के लिए विशिष्ट नहीं सह immunoprecipitated प्रोटीन बाहर शासन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक सुविधाजनक, अति विशिष्ट नियंत्रण पेप्टाइड (SMRmut) की पहचान की. एस के साथ एक पेप्टाइड का उपयोगबल्कि पूर्ण लंबाई प्रोटीन से ब्याज की pecific डोमेन हमें Nef 19 में अन्य डोमेन के लिए बाध्य है कि सेलुलर कारकों के दर्जनों की स्क्रीनिंग को बायपास करने की अनुमति दी.
एक बार जब हम एक तार्किक अगले कदम पहचान सेलुलर बाध्यकारी भागीदारों जैविक समारोह 18 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि दिखाने के लिए था, SMR बाध्यकारी भागीदारों की पहचान की. यह पूरा करने के लिए मानक प्रक्रिया जैविक समारोह पर लक्ष्य प्रोटीन विशिष्ट miRNA या siRNA में, और बाद में परख प्रभाव का उपयोग कर पछाड़ना प्रोटीन का स्तर है. हम इस मामले में एक SMR बाध्यकारी प्रोटीन में, कि लक्ष्य के उत्पादन को कम करने, लक्ष्य mRNA के अनुवाद को रोकता है जो miRNA के पछाड़ना, प्रदर्शन किया. लक्ष्य प्रोटीन की यह कमी एक अप्रत्यक्ष प्रभाव है, और संभवतः लक्षित प्रोटीन नतीजतन अंदर एक भूमिका निभाता जैविक समारोह पर एक देरी प्रभाव पड़ता है, हम भी सीधे की गतिविधि में खलल न डालें, तो यह निर्धारित करने के लिए कम आम एंटीबॉडी निषेध तकनीक कार्यरतलक्ष्य प्रोटीन जैविक समारोह कम कर देता है या समाप्त. इस प्रक्रिया में, एंटीबॉडी लक्षित प्रोटीन के खिलाफ उठाया रथ अभिकर्मक का उपयोग कर सेल में ट्रांसफ़ेक्ट, और लक्ष्य प्रोटीन या तो समारोह की अपनी साइट से sequestering यह, या अपने प्रासंगिक बाध्यकारी डोमेन रोकने के साथ सीधे बातचीत कर रहे हैं. इस प्रक्रिया के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन का निषेध सीधे अपने कार्य बाधित है, और आगे जैविक समारोह के लिए लक्ष्य प्रोटीन के महत्व की पुष्टि के द्वारा आरएनए पछाड़ना प्रक्रियाओं के पूरक कर सकते हैं.
रथ अभिकर्मक कोशिकाओं में पेप्टाइड्स और प्रोटीन पहुंचाने में कारगर है, इस प्रक्रिया में समय लगता है और प्रयोगों के प्रकार की सीमा जैसे लंबे समय तक या दोहराया जोखिम और इन विवो जानवरों के अध्ययन में किया जा सकता है. नतीजतन, हम निष्क्रिय कोशिकाओं द्वारा उठाया जा सकता है कि एक पेप्टाइड उत्पन्न करने SMRwt पेप्टाइड (SMRwt-सीपीपी) 18 के लिए एक सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड (सीपीपी) अनुक्रम जोड़ासंस्कृति मीडिया से. इस संस्करण में बाधा exNef स्राव में पूर्व के रूप में प्रभावी था.
इन प्रकाशित प्रयोगों से साक्ष्य प्रतिस्पर्धी निषेध के माध्यम से पूर्ण लंबाई प्रोटीन के समारोह के विरोध करने के लिए, और इन रूपांकनों कि बाँध प्रोटीन को अलग करने के लिए विशिष्ट कार्यात्मक रूपांकनों युक्त छोटे पेप्टाइड की क्षमता को दर्शाता है. इनमें से एक तकनीक कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में उपयोगी होना चाहिए कि उम्मीद करेंगे. उन्होंने यह भी कई सेलुलर प्रक्रियाओं के इंजीनियरिंग उपन्यास पेप्टाइड inhibitors में प्रभावी होना चाहिए, सीपीपी दृश्यों के लिए कड़ी से आगे बढ़ाया जा सकता है कि एक समारोह.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exosomal तस्करी मार्ग exNef स्राव के इंजीनियरिंग उपन्यास inhibitors में उपयोगी होगा हेरफेर करने Nef की क्षमता अंतर्निहित तंत्र को समझना. ExNef स्राव का निषेध सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण और सीआईए ड्राइव कि एचआईवी / एड्स के रोगजन…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच / NIGMS / MBRS (अनुदान 58268), एनआईएच / NCRR / RCMI (अनुदान G12-RR03034), जॉर्जिया रिसर्च एलायंस के वित्त पोषण अनुदान GRA.VAC08.W, एनआईएच / NIAID / एनआरएसए अनुदान F31AI091484, एमोरी CFAR अनुदान P30 द्वारा समर्थित किया गया A1050409. इस जांच एनआईएच / NCRR से अनुसंधान सुविधाएं सुधार अनुदान # C06 RR18386 से समर्थन के साथ निर्माण एक सुविधा में आयोजित किया गया. Jurkat कोशिकाओं, 20 के सेट एचआईवी -1 Nef पेप्टाइड्स, साथ ही खरगोश विरोधी एचआईवी -1 Nef सीरमरोधी एनआईएच एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम, (रॉकविल, एमडी) से प्राप्त किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
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