La identificación basada en péptidos de motivos funcionales y sus parejas de unión
Summary
Se describen técnicas para diseccionar los mecanismos que subyacen a la secreción de VIH-1 Nef en exosomas. Péptidos específicos cortos derivados de la proteína Nef y transfección fueron explotados para determinar la estructura, la función y las parejas de unión de la secreción Modificación Región de Nef. Estos procedimientos tienen importancia general en muchos estudios sobre el mecanismo.
Abstract
Péptidos específicos cortos derivados de motivos encontrados en proteínas de longitud completa, en nuestro caso el VIH-1 Nef, no sólo conservan su función biológica, pero también pueden inhibir competitivamente la función de la proteína de longitud completa. Un conjunto de 20 péptidos de escaneo Nef, 20 aminoácidos de longitud cada uno con superposición de 10 aminoácidos de su vecino, se utilizaron para identificar los motivos en Nef responsable de su inducción de la apoptosis. Los péptidos que contienen estos motivos apoptóticas inducidas la apoptosis en niveles comparables a la proteína Nef de longitud completa. Un segundo péptido, derivado de la región Modificación secreción (SMR) de Nef, retiene la capacidad de interactuar con las proteínas celulares implicados en la secreción de Nef en exosomas (exNef). Este péptido SMRwt se utilizó como la proteína "cebo" en experimentos de co-inmunoprecipitación para aislar las proteínas celulares que se unen específicamente al motivo SMR de Nef. Se utilizó la transfección y anticuerpos de inhibición de la proteína para alterar físicamente la apuesta interacciónween Nef y mortalin, una de las proteínas de unión a SMR aisladas, y el efecto se midió con un ensayo de secreción de exNef fluorescente basada. La capacidad del péptido SMRwt a outcompete Nef de longitud completa de proteínas celulares que se unen el motivo SMR, lo convierten en el primer inhibidor de la secreción exNef. Por lo tanto, mediante el empleo de las técnicas descritas aquí, que utilizan las propiedades únicas de los péptidos específicos cortos derivados de motivos encontrados en proteínas de longitud completa, se puede acelerar la identificación de motivos funcionales en las proteínas y el desarrollo de inhibidores basados en péptidos de funciones patógenos.
Introduction
Con el advenimiento de la terapia anti-retroviral, la epidemia de SIDA en el mundo occidental se ha ralentizado, pero no restringido, y la propagación del VIH continúa siendo una importante carga para la salud en todo el mundo. Con la excepción del ensayo marginalmente eficaces RV144 tailandés, vacunas contra el VIH han demostrado hasta ahora la falta de protección de la infección. Por lo tanto, la investigación de posibles dianas terapéuticas, otros todavía se justifica.
Junto con el agotamiento de células T CD4, la activación inmune generalizada persistente es un sello de la infección por VIH. Esta activación inmune crónica (CIA) conduce a un aumento de la renovación celular, las subpoblaciones linfocitarias activadas y diferenciada, el agotamiento y la senescencia celular y la muerte de las células T y las células B a través de la activación inducida por la muerte celular (AICD) 1,2,3, y se ha consolidado como uno de los más fuertes predictores de progresión de la enfermedad 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la CIA y CD4El agotamiento de la infección por VIH de las células T aún no se han aclarado por completo.
La evidencia de nuestro laboratorio y otros nos condujo a un modelo para la progresión de la enfermedad (Figura 1) en el que la proteína Nef del VIH (factor regulador negativo) induce su secreción en exosomas de células infectadas por el VIH-1 13,14. Estos exosomas que contienen Nef (exNef) inducen la apoptosis en una serie de linajes de células incluyendo las células T CD4 no infectados 15,16. Alternativamente, en monocitos / macrófagos exNef altera los patrones de expresión génica, por ejemplo, la expresión de citoquinas, y parece inducir un estado de activación inmune no programada. Este cuerpo de evidencia sugiere un papel importante para exNef de la CIA y el agotamiento de las células T CD4.
La comprensión de los mecanismos que subyacen a la capacidad de Nef para manipular el tráfico de la vía exosomal será útil en la ingeniería de nuevos inhibidores de la secreción de exNef. La inhibición de la secreción de exNef debe disminuir el agotamiento de células T CD4y la CIA que patogénesis unidad de VIH / SIDA.
Para recopilar la evidencia que condujo a nuestro modelo de progresión de la enfermedad del VIH / SIDA y los datos posteriores que construyeron en este modelo, hemos desarrollado una serie de nuevos reactivos y metodologías que nos permitió analizar la genética de la secreción exNef, y comenzamos a determinar la proteínas celulares implicadas. En el trabajo inicial, se encontró que la proteína Nef induce la apoptosis en células espectadoras y se libera extracelularmente a partir de células transfectadas con y Nef del VIH-infectada 15. Los péptidos derivados de (células del estroma Derived Factor-1, con alfa corte y empalme alternativo) SDF-1α se había demostrado previamente para retener gran parte de la actividad de unión y la señalización de la molécula de longitud completa 17. Especulamos que los péptidos de Nef pueden retener parte de la actividad apoptótica de la proteína completa, y que estos péptidos serían necesariamente contener el dominio apoptótica Nef (s). Para identificar estos péptidos, y en consecuencia, la Nefdominio apoptótica (s), se obtiene un conjunto de 20 HIV-1 Nef péptidos de exploración del Programa de reactivos de referencia NIH Investigación y el SIDA. Estos péptidos 20-aa, cada una superposición de 10 aminoácidos de su vecino, se nombran por el número de su último aminoácido, es decir, N20 Nef se extiende por los aminoácidos 1-20, N30 abarca los aminoácidos Nef 11-30, 16, etc. Hemos encontrado que la exposición de células T a péptidos específicos extracelularmente superposición de dos dominios 10-aa distintas en la apoptosis inducida por la proteína Nef de longitud completa en estas células. El análisis posterior de estos péptidos apoptóticos Nef-derivados reveló su capacidad para interactuar físicamente con el receptor de quimiocinas CXCR4 en la superficie de las células T, con la cinética de unión que permitieron estos péptidos para inhibir competitivamente la unión entre el CXCR4 y su ligando natural SDF-1α. Finalmente, se encontró que la interacción de los péptidos apoptóticos Nef-derivados »con CXCR4 para inducir una respuesta de estrés en estas células T que conducen a la apoptosis. Esta evidencia nos permitió quicdominios funcionales de kly mapa Nef, un proceso que habría llevado mucho más tiempo utilizando técnicas mutagénicos de ADN estándar, tales como alanina mutagénesis de barrido. También mostró que estos péptidos cortos derivados de Nef-conservan la función biológica de los dominios apoptóticas en la proteína de longitud completa.
Después de haber definido el papel de Nef extracelular, es decir, la apoptosis de las células T, que buscó una mejor comprensión de cómo Nef se secreta a partir de las células. Utilizando una serie de construcciones Nef mutados, mapeamos altamente conservadas de proteínas Nef motivos en las regiones N-terminales de ambos Nef del VIH, y su macaco Rhesus equivalente SIV Mac (virus de inmunodeficiencia simia) Nef, que son críticos para la secreción de exNef 13. Uno de estos motivos, la Región Modificación secreción (SMR; 66VGFPV70), fue particularmente crítico, como la sustitución de alanina cualquiera de sus cinco aminoácidos ya sea en gran medida reducido o abolido la secreción exNef. Cuando se suministra a las células a través de C de Active MotifHariot Proteína Reactivo de entrega, un péptido que contiene el SMR unido a una secuencia de péptido FLAG (SMRwt) fue encontrado para inhibir la secreción de exNef tanto Nef-transfectadas y células infectadas por VIH-18. En base a nuestra experiencia previa con péptidos, se decidió utilizar este péptido para dilucidar las moléculas y los mecanismos que subyacen a la función del Nef SMR en la secreción exNef.
Uso del péptido SMRwt como nuestro "proteína cebo", que co-immunoprecipitated parejas de unión celular de la SMR a partir de lisados de células T no infectadas 18. La secuencia de péptido FLAG proporciona un mango conveniente para capturar el péptido SMRwt usando resina de afinidad anti-FLAG. La anterior conclusión de que una sola mutación de valina por alanina en el péptido SMRwt era suficiente para suprimir la inhibición de la secreción de exNef identificado un péptido control conveniente, altamente específico (SMRmut) que se utilizó para descartar las proteínas co-immunoprecipitated no específicos para el SMR. El uso de un péptido con la sdominio ESPECÍFICOS de interés en lugar de la proteína de longitud completa nos permitió pasar por alto la detección de decenas de factores celulares que se unen a otros dominios en Nef 19.
Una vez que se identificaron los socios SMR-unión, el siguiente paso lógico era mostrar que las parejas de unión celulares identificados son importantes para la función biológica 18. El procedimiento estándar de lograr esto es a los niveles de proteína desmontables utilizando los genes miARN objetivo o ARNsi específico de la proteína, y posteriormente se ensayo el efecto sobre la función biológica. Se realizó caída miARN, que inhibe la traducción del ARNm diana, la reducción de la producción de ese objetivo, en este caso una proteína de unión a SMR. Esta reducción de la proteína diana es un efecto indirecto, y posiblemente tiene un efecto retardado sobre la función biológica de la proteína objetivo juega un papel pulg Por consiguiente, también empleó la técnica menos común de la inhibición de anticuerpos para determinar si interrumpir directamente la actividad dela proteína diana reduce o elimina la función biológica. En este procedimiento, los anticuerpos producidos contra la proteína específica se transfectan en la célula usando Reactivo carro, e interactúan directamente con la proteína diana o bien secuestrante que desde su sitio de función, o el bloqueo de su dominio de unión relevante. La inhibición de la proteína diana a través de este procedimiento altera directamente su función, y puede complementar los procedimientos desmontables de ARN por confirmar aún más la importancia de la proteína diana a la función biológica.
Mientras carro de reactivos es eficaz en la entrega de péptidos y proteínas en las células; este proceso consume mucho tiempo y limita los tipos de experimentos, por ejemplo, la exposición prolongada o repetida y en estudios con animales in vivo que se puede realizar. En consecuencia, hemos añadido una secuencia de péptido de penetración celular (CPP) para el péptido SMRwt (SMRwt-CPP) 18 para generar un péptido que podría ser tomado por las células pasivamentede los medios de cultivo. Esta versión fue tan eficaz como la antigua en la inhibición de la secreción de exNef.
La evidencia de estos experimentos publicados demuestra la capacidad de pequeños péptidos que contienen motivos funcionales específicos para antagonizar la función de la proteína de longitud completa a través de la inhibición competitiva, y para aislar las proteínas que se unen a estos motivos. Uno esperaría que estas técnicas deben ser útiles en muchos protocolos experimentales. Ellos también deben ser eficaces en nuevos inhibidores peptídicos de ingeniería de muchos procesos celulares; una función que puede ser mejorada aún más mediante la unión a secuencias de CPP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La comprensión de los mecanismos que subyacen a la capacidad de Nef para manipular el tráfico de la vía exosomal será útil en la ingeniería de nuevos inhibidores de la secreción de exNef. La inhibición de la secreción de exNef debe disminuir el agotamiento de células T CD4 y la CIA que patogénesis unidad de VIH / SIDA. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado una serie de nuevos reactivos y metodologías que nos permitió analizar la genética de la secreción exNef, y comenzamos a determinar las proteí…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta trabajo fue apoyado por NIH / NIGMS / del SAM (Grant 58268), NIH / CNRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance concesión de financiación GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA subvención de F31AI091484, Emory subvención de CFAR P30 A1050409. Esta investigación se llevó a cabo en un instalación construida con el apoyo de Investigación Instalaciones Improvement Grant # C06 RR18386 a partir NIH / CNRR. Los las células Jurkat, el conjunto de 20 el VIH-1 péptidos Nef, como así como la de conejo anti-el VIH-1 Nef antisuero fueron obtenerse a a partir de la SIDA de los NIH Investigación & Programa de reactivos de Referencia, (Rockville, MD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
- Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen?. Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
- Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
- Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
- Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
- Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
- Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
- Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
- Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef’s interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
- Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
- Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).
