Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Summary

Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

Abstract

Péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento total, no nosso caso, o HIV-1 Nef, não só mantêm a sua função biológica, mas também pode inibir competitivamente a função da proteína de comprimento completo. Um conjunto de 20 péptidos Nef de varrimento, de 20 aminoácidos de comprimento, com cada uma sobreposição de 10 aminoácidos do seu vizinho, foram utilizados para identificar motivos de Nef responsável pela sua indução de apoptose. Os péptidos que contêm estes motivos apoptóticos apoptose induzida em níveis comparáveis ​​aos da proteína Nef de comprimento completo. Um segundo péptido, derivado da região Modificação Secreção (SMR) da Nef, reteve a capacidade de interagir com as proteínas celulares envolvidas na secreção de Nef no exosomes (exNef). Este péptido SMRwt foi usado como o "isco" proteína em experiências de co-imunoprecipitação de isolar as proteínas celulares que se ligam especificamente ao motivo do SMR Nef. A transfecção e o anticorpo de inibição da proteína foi utilizado para destruir fisicamente a aposta interacçãoween Nef e mortalin, uma das proteínas de ligação ao SMR isolado, e o efeito foi medido com um ensaio de secreção exNef baseado fluorescente. A capacidade do peptídeo de SMRwt para superá Nef completo para proteínas celulares que se ligam o motivo SMR, torná-lo o primeiro inibidor da secreção exNef. Assim, empregando as técnicas aqui descritas, que utilizam as propriedades únicas de péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento completo, pode-se acelerar a identificação de motivos funcionais em proteínas e ao desenvolvimento de inibidores à base de péptidos de funções patogénicos.

Introduction

Com o advento da terapia anti-retroviral, a epidemia de aids no mundo ocidental tem sido abrandado, mas não reduzido, ea propagação do HIV continua a ser um importante problema de saúde em todo o mundo. Com a excepção do marginalmente eficaz RV144 Thai ensaio, vacinas anti-HIV até agora mostraram falta de protecção contra a infecção. Assim, a investigação sobre potenciais alvos terapêuticos adicionais, ainda se justifica.

Junto com depleção de células T CD4, ativação imune generalizada persistente é uma característica da infecção pelo HIV. Esta ativação imune crônica (CIA) leva a um aumento no volume de células, subpopulações linfocitárias ativadas e diferenciadas, a exaustão celular e senescência, ea morte de células T e células B através da ativação morte celular induzida (AICD) ^1,2,3, e está bem estabelecido como um dos mais fortes preditores de progressão da doença ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12.} No entanto, os mecanismos subjacentes a CIA e CD4Depleção na infecção por VIH de células T ainda de ser completamente elucidados.

Evidência do nosso laboratório e outros levaram-nos a um modelo para a progressão da doença (Figura 1) em que a proteína Nef do HIV (factor regulador negativo) induz a sua secreção no exosomes de células infectadas pelo HIV-1 ^13,14. Estes exosomes Nef contendo (exNef) induzir a apoptose em diversas linhagens de células não infectadas incluindo células CD4 células T ^15,16. Alternativamente, em monócitos / macrófagos exNef altera os padrões de expressão de genes, por exemplo, expressão de citoquinas e parece induzir um estado de activação imunitária marcação. Esse corpo de evidências sugere um papel importante para exNef na CIA e depleção de células T CD4.

A compreensão dos mecanismos subjacentes à capacidade da Nef manipular o caminho de tráfico exosomal será útil em inibidores da secreção exNef novos engenharia. A inibição da secreção exNef deve diminuir a depleção de células T CD4e CIA que patogênese unidade HIV / AIDS.

Para reunir as provas que levaram ao nosso modelo para o HIV / AIDS a progressão da doença e os dados posteriores que construíram sobre este modelo, desenvolvemos uma série de novos reagentes e metodologias que nos permitiu analisar a genética da secreção exNef, e começar a determinar a proteínas celulares envolvidas. No trabalho inicial, descobrimos que a proteína Nef, induz a apoptose em células espectadoras e é libertado extracelularmente a partir de células transfectadas com e Nef do HIV-infected ^15. Os péptidos derivados a partir de (célula estromal Derived Factor de-1, alfa com splicing alternativo) SDF-1α tinha sido previamente demonstrado para reter a maior parte da actividade de ligação e sinalização da molécula de comprimento completo ^17. Especulou-se que os peptídeos de Nef pode reter uma parte da actividade apoptótica da proteína total, e que estes péptidos seriam necessariamente conter o domínio apoptótica Nef (s). Para identificar esses peptídeos, e, conseqüentemente, a Nefdomínio apoptótica (s), obteve-se um conjunto de 20 HIV-1 Nef peptídeos digitalização a partir do NIH Research AIDS e do Programa de reagente de referência. Estes péptidos de 20-aa, cada sobrepondo 10 aminoácidos do seu vizinho, são denominados pelo número do último aminoácido, isto é, N20 vãos Nef aminoácidos 1-20, N30 vãos Nef aminoácidos 11-30, ^16, etc. Descobrimos que a exposição de células T a péptidos específicos extracelularmente sobrepostos dois domínios de 10-aa distintos na proteína Nef de comprimento completo a apoptose induzida nessas células. Análise subsequente destes péptidos apoptóticos Nef derivados revelou a sua capacidade para interagir fisicamente com o receptor de quimiocina CXCR4 na superfície das células T, com a cinética de ligação que permitem estes péptidos para inibir competitivamente a ligação entre o CXCR4 e o seu ligando natural, SDF-1α. Finalmente, a interação dos peptídeos apoptóticos Nef derivados com CXCR4 foi encontrado para induzir uma resposta de estresse nestas células T-levando a apoptose. Esta prova permitiu quicdomínios funcionais da kly mapa Nef, um processo que teria levado muito mais tempo usando técnicas de mutagênicos DNA padrão, tais como alanina mutagênese de varredura. Também mostrou que estes péptidos curtos derivados de Nef mantida a função biológica dos domínios apoptóticas na proteína de comprimento completo.

Tendo identificado um papel para Nef extracelular, ou seja, a apoptose das células T, procuramos uma melhor compreensão de como a Nef foi segregada a partir de células. Usando uma série de construções mutadas Nef, que mapeada altamente conservadas motivos de proteína Nef nas regiões N-terminais de ambas Nef do HIV, e sua equivalente Rhesus macaque _mac SIV (vírus da imunodeficiência dos símios) Nef, que são críticos para a secreção exNef ^13. Um destes motivos, a Região Modificação Secreção (SMR; 66VGFPV70), era particularmente crítico, como a substituição de alanina de qualquer dos seus cinco aminoácidos ou grandemente reduzida ou abolida secreção exNef. Quando entregue às células via C do Motif atividadeHariot Proteína Reagente de entrega, um peptídeo contendo o SMR ligado a uma sequência de péptido FLAG (SMRwt) foi encontrada para inibir a secreção de ambas exNef Nef transfectadas e células infectadas pelo HIV ^18. Com base em nossa experiência anterior com peptídeos, decidimos usar esse peptídeo para elucidar as moléculas e os mecanismos subjacentes papel do Nef SMR na secreção exNef.

Utilizando o nosso péptido SMRwt como "proteína de isco", que co-imunoprecipitada parceiros de ligação celulares do SMR a partir de lisados ​​de células ^T-18 não infectadas. A sequência do péptido FLAG fornecida uma pega conveniente para capturar o péptido SMRwt usando resina de afinidade anti-FLAG. Nossa conclusão anterior de que um único valina para alanina mutação no peptídeo SMRwt foi suficiente para abolir a inibição da secreção de exNef identificado um peptídeo controle conveniente, altamente específico (SMRmut) que usamos para descartar proteínas co-imunoprecipitadas não específicos para a SMR. Utilização de um péptido com a sESPECÍFICAS domínio de interesse, em vez de a proteína de comprimento completo permitiu ultrapassar o rastreio de dezenas de factores celulares que se ligam a outros domínios Nef ^19.

Uma vez identificados os parceiros de ligação de SMR, o próximo passo lógico foi mostrar que os parceiros de ligação celulares identificados são importantes para a função biológica ^18. O procedimento padrão para realizar isto é a níveis de proteína de knockdown utilizando miRNA proteína-alvo específico ou siRNA, e subsequentemente ensaio o efeito sobre a função biológica. Realizou knockdown miRNA, que inibe a tradução do ARNm alvo, reduzindo a produção desse objectivo, neste caso, uma proteína de ligação ao SMR. Esta redução da proteína alvo é um efeito indirecto, e, possivelmente, tem um efeito de atraso sobre a função biológica da proteína alvo tem um papel cm consequência, também empregaram a técnica menos comum de inibição de anticorpos para determinar se perturbar directamente a actividadea proteína alvo reduz ou elimina a função biológica. Neste processo, os anticorpos criados contra a proteína alvo são transfectados para a célula usando Reagente Carruagem, e interagir directamente com a proteína alvo, quer sequestrando-do seu local de função, ou o seu domínio de ligação de bloqueio pertinentes. A inibição da proteína-alvo através deste procedimento interrompe directamente a sua função, e pode complementar os procedimentos de knockdown de ARN, confirmando ainda a importância da proteína alvo para a função biológica.

Enquanto Reagente Carruagem é eficaz no fornecimento de peptídeos e proteínas para as células, este processo é demorado e limita os tipos de experiências, por exemplo, a exposição repetida ou prolongada e em estudos em animais in vivo que podem ser executadas. Consequentemente, adicionou-se uma sequência de péptido de célula-penetrante (CPP) para o péptido SMRwt (SMRwt-CPP) ¹⁸ para gerar um péptido que pode ser absorvido pelas células passivamentea partir dos meios de cultura. Esta versão foi tão eficaz como o ex-exNef inibir a secreção.

A evidência a partir destas experiências publicadas demonstra a capacidade de péptidos pequenos contendo motivos funcionais específicos para antagonizar a função da proteína de comprimento completo através da inibição competitiva, e para isolar as proteínas que se ligam a estes motivos. Seria de esperar que estas técnicas pode ser útil em vários protocolos experimentais. Eles também devem ser eficazes em novos inibidores de muitos processos celulares peptídeo engenharia; uma função que pode ser reforçada pela ligação a seqüências CPP.

Protocol

I. Utilização de péptidos curtos, em análise biológica I.1. Mapeamento Motivos Biologicamente funcional utilizando Peptídeos Tratar as células com os péptidos de digitalização Nef Obter um conjunto de peptídeos de varredura da região de interesse. Para as nossas experiências, os péptidos 20-mer, com 10 sobreposição de aminoácidos, que abrangem toda a proteína HIV-1 Nef (205 aa) foram obtidas a partir do Programa Reagente de SIDA. Os péptidos são ensaiados…

Representative Results

Mapeamento Motivos Biologicamente Funcionais utilizando péptidos. Duas regiões foram identificados nas proteínas Nef que induzem a apoptose. Apoptose Peptídeo orientado foi observada (Figura 2), começando com o péptido N50 (AA30-50), atingindo um máximo de N60 (AA40-60) e N70 (aa50-70), e para diminuir os níveis de base de péptido N100 (aa80-100). O principal motivo 1 (M1), pico, centrando-aa50-60, induz> 80% dos níveis de apoptóticos da proteína Nef de comprimento comple…

Discussion

A compreensão dos mecanismos subjacentes à capacidade da Nef manipular o caminho de tráfico exosomal será útil em inibidores da secreção exNef novos engenharia. A inibição da secreção exNef deve diminuir a depleção de células T CD4 e CIA que patogênese unidade HIV / AIDS. Para atingir este objetivo, temos desenvolvido uma série de novos reagentes e metodologias que nos permitiu analisar a genética da secreção exNef, e começar a determinar as proteínas celulares envolvidas. Esta abordagem também lev…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
20mer peptide set with 10 amino acid overlap	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	4641
TUNEL Assay	Roche	11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent	Active Motif	30100
Tecan GENEios fluorimeter	(Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate	Corning	3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Millipore	ZTC18S096	C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF