Peptide-baserte Identifikasjon av Funksjonelle Motifs og deres Binding Partnere

Summary

Teknikker for å dissekere mekanismene bak utskillelsen av HIV-1 Nef i exosomes er beskrevet. Spesifikke korte peptider avledet fra Nef protein transfeksjon ble utnyttet for å bestemme strukturen, funksjonen og bindingspartnere av Nef Sekresjon Modification Region. Disse prosedyrene har generell relevans i mange mekanistiske studier.

Abstract

Spesifikke korte peptider avledet fra motiver finnes i full-lengde proteiner; i denne samanheng HIV-1 Nef, ikke bare beholder deres biologiske funksjon, men kan også kompetitivt hemme funksjonen til den full-lengde protein. Et sett med 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyrer i lengde med hver overlappende 10 aminosyrer av nabo dets fordeling, ble brukt til å identifisere motivene i Nef ansvarlig for sin induksjon av apoptose. Peptider inneholdende disse apoptotic motivene indusert apoptose på nivåer sammenlignbare til den full-lengde Nef protein. En andre peptid, avledet fra den Sekresjon Modification Region (SMR) av Nef, beholdt muligheten til å samhandle med cellulære proteiner involvert i Nef 's sekresjon i exosomes (exNef). Dette SMRwt peptid ble brukt som den "agn" protein i co-immunoprecipitation eksperimenter for å isolere cellulære proteiner som binder spesifikt til Nef-'s smr motiv. Protein transfeksjon og antistoff hemming ble brukt til å fysisk forstyrre samspillet betWeen Nef og mortalin, ett av de isolerte SMR-bindende proteiner, og den effekten ble målt med et fluorescent-basert exNef sekresjon-analysen. The SMRwt peptid evne til å utkonkurrere full-lengde Nef for cellulære proteiner som binder den SMR motiv, gjøre det den første hemmer av exNef sekresjon. Således, ved anvendelse av de teknikker som er beskrevet her, som drar nytte de unike egenskapene til spesifikke korte peptider avledet fra motiver finnes i full-lengde proteiner, kan det hende man akselerere den identifikasjon av funksjonelle motiva i heile proteiner og den utvikling av peptid-baserte hemmere av patogene-funksjoner.

Introduction

Med den advent av anti-retroviral terapi, har den AIDS epidemien i den vestlige verden blitt bremset, men ikke curtailed, og spredningen av HIV fortsetter å være en stor helse byrde over hele verden. Med unntak av den marginalt effektive RV144 Thai rettssaken, har HIV-vaksiner så langt vist unnlatelse av å beskytte fra infeksjon. Således, er forskning inn i ytterligere, potensielle terapeutiske mål fortsatt hjemlet.

Sammen med CD4 T-celle uttømming, er persistent generalisert immune aktivering et kjennetegn på HIV infeksjon. Denne Kronisk Immune Activation (CIA) fører til øker i celle omsetning, påslåtte og differensiert lymfocytiske subpopulasjoner, cellular utmattelse og senescence, og drapet av T-celler og B-celler via Activation-Induced Cell Death (AICD) ^1,2,3, og det er godt etablert som en av de sterkeste prediktorer av sykdom progresjon ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12.} Imidlertid, de mekanismene som ligger til grunn CIA og CD4T-celle uttømming hos HIV-infeksjon er fortsatt ikke helt klarlagt.

Bevis fra vår lab og andre førte oss til et modell for sykdom progresjon (Figur 1) hvori den HIV protein Nef (Negativ Regulatory Factor) induserer sin sekresjon i exosomes fra HIV-ett infiserte celler ^13,14. Disse Nef-holdige exosomes (exNef) indusere apoptose i et antall av celle slektsnavn inkludert uninfected CD4 T-celler ^15,16. Alternativt, i monocytter / makrofager exNef endrer gene expression mønstre, f.eks cytokin uttrykk, og ser ut til å indusere en tilstand av unscheduled immune aktivering. Denne kropp av bevis tyder på en viktig rolle for exNef i CIA og CD4 T-celle uttømming.

Forstå de mekanismene bak Nef evne til å manipulere den exosomal trafficking pathway vil være nyttig seg på engineering romanen hemmere av exNef sekresjon. Hemming av exNef sekresjon bør minske den CD4 T-celle uttømmingog CIA at stasjonen HIV / AIDS patogenesen.

Å samle bevisene som førte til våre modell for HIV / AIDS sykdom progresjon og de påfølgende data som bygde bort på denne modellen, utviklet vi en rekke av romanen reagenser og metodologier som mulig for oss til å analysere de genetikk av exNef sekresjon, og begynne å bestemme den cellulære proteiner involvert. I det innledende arbeidet, fant vi at Nef protein induserer apoptose i tilskuer celler og er utgitt ekstracellulært fra Nef-transfekterte og HIV-infiserte celler ^15. Peptider avledet fra SDF-1α (Stromale celle Avledet Factor-1, med alternativ spleising alfa) hadde blitt tidligere er vist å beholde mye av den bindende og signalnettverk aktivitet av den full-lengde molekyl ^17.. Vi spekulert i at peptidene fremstilt Nef kanskje vil beholde noen av den apoptose aktivitet av den fulle protein, og at disse peptidene nødvendigvis ville inneholde den Nef-apoptotisk domene (e). Å identifisere disse peptider, og følgelig den Nefapoptotisk domene (s), innhentet vi et sett av 20 HIV-en Nef skanning peptider fra den NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Disse tjue-aa peptider, er hver overlappende 10 aminosyrer av nabo sin, oppkalt med antall av deres siste amino syre, N20 dvs. spenn Nef aminosyrer 1-20, N30 spenn Nef aminosyrer 11-30, ¹⁶ etc. Vi fant ut at å utsette t-celler ekstracellulært til spesifikke peptider overlappende to distinkte 10-AA domener i den full-lengde Nef-protein som indusert apoptose i disse cellene. Oppfølgende analyse av disse Nef-deriverte apoptotic peptider avslørt deres evne til å fysisk samhandle med den chemokine reseptoren påvist CXCR4 på overflaten av t-celler, med bindende kinetikk som tillot disse peptidene for å kompetitivt inhibere binding mellom kl CXCR4 og dens naturlige ligand SDF-1α. Til slutt, ble de Nef-deriverte apoptotiske peptider 'interaksjon med CXCR4 funnet å indusere en stress respons i disse T-celler som fører til apoptose. Dette bevis tillatt oss å quickly map Nef 's funksjonelle domener; en prosess som ville ha tatt mye lenger ved hjelp av standard DNA-mutagene teknikker som for eksempel alanine skanning mutagenese. Den viste samtidig at disse korte Nef–deriverte peptider beholdt den biologiske funksjon av de apoptotic domenene i den full-lengde protein.

Etter å ha identifisert en rolle for extracellular Nef, dvs. apoptose av T-celler, søkte vi en bedre forståelse av hvordan Nef ble secreted fra celler. Ved hjelp av en serie av muterte NEF-konstruerer, vi kartlagt svært konservert Nef protein motivene i de N-terminale regioner av både HIV Nef, og dens Rhesus macaque ekvivalent SIV _mac (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, at er kritiske for exNef sekresjon ^13.. En av disse motivene, den Sekresjon Modification Region (SMR; 66VGFPV70), var spesielt kritisk, som alanin utskifting av en hvilken som helst av sine fem aminosyrer enten sterkt redusert eller avskaffet exNef sekresjon. Når den leveres til celler via Active Motif 's Chariot Protein Delivery Reagent, et peptid inneholdende smr festet til en FLAG peptid sekvens (SMRwt) ble funnet å hemme exNef sekresjon fra både Nef-transfekterte og HIV-smittet celler ^18.. Basert på vår forrige erfaring med peptider, besluttet vi å bruke denne peptid til å belyse de molekyler og mekanismer ligger til grunn for Nef SMR 's rolle i exNef sekresjon.

Ved hjelp den SMRwt peptid som vår "agn protein", vi co-immunutfelt cellulære bindende partnere av den SMR fra uinfiserte T-celle lysates ^atten. The FLAG peptid rekkefølgen de er angitt en praktisk håndtak for å fange den SMRwt peptid ved hjelp av anti-FLAG affinitet resin. Vår forrige funn at en enkelt valine til alanin mutasjon i den SMRwt peptid var tilstrekkelig for avskaffe sin hemming av exNef sekresjon identifisert en praktisk, svært spesifikk kontroll peptid (SMRmut) at vi pleide å utelukke co-immunutfelt proteiner ikke spesifikke for den SMR. Ved hjelp av en peptid med den specific domenet av interesse snarere enn den fulle-lengde protein tillatt oss til å omgå den screening av dusinvis av cellulære faktorer som binder seg til andre domener i Nef ^19..

Når vi identifisert de SMR-bindende partnere, et logisk neste skritt var å vise at de identifiserte mobilnettet bindende partnere er viktige for det biologiske funksjon ^18. Den standard prosedyre for å oppnå dette er å knockdown protein nivåer ved hjelp av mål protein-spesifikk miRNA eller siRNA, og senere assay den effekt på den biologiske funksjon. Vi utførte miRNA knockdown, noe som hindrer translasjon av målet-mRNA, noe som reduserer produksjonen av av målet, med i dette tilfellet en smr-bindende protein. Denne reduksjon av målet protein er en indirekte effekt, og muligens har en tidsforskjøvet utslag for biologiske funksjonen den målrettet proteinet spiller en rolle i. Følgelig, vi også knyttet den mindre vanlige antistoff hemming teknikk for for å fastslå om direkte forstyrre den aktiviteten avmålet protein reduserer eller eliminerer den biologiske funksjon. I denne prosedyren, antistoffer dyrket mot den målrettet proteinet blir transfektert inn i cellen ved hjelp av Chariot Reagent, og samhandle direkte med målet protein enten sequestering den fra sin stedet av funksjon, eller blokkere dens relevant bindende domene. Inhibering av målet protein gjennom denne prosedyre direkte forstyrrer til funksjon, og kan utfylle RNA-knockdown prosedyrer ved å noe bekrefter viktigheten av målet protein til den biologiske funksjon.

Mens Chariot Reagent er effektiv på å levere peptider og proteiner inn i celler; denne prosessen er tidkrevende og begrenser hvilke typer eksperimenter, f.eks forlenget eller gjentatt eksponeringer og in vivo dyrestudier som kan utføres. Følgelig, lagt til vi en celle-gjennomtrengende peptid (CPP)-sekvens til SMRwt peptid (SMRwt-CPP) ¹⁸ til å generere et peptid som kunne bli tatt opp av celler passivtfra de kulturmedier. Denne versjonen var like effektivt som det tidligere ved hemme exNef sekresjon.

Beviset fra disse publiserte eksperimentene demonstrerer den evne av små peptider inneholdende spesifikke funksjonelle motiv som kan antagonize funksjonen til den full-lengde protein gjennom kompetitiv hemming, og for å isolere de proteiner som binder til desse motiva. En ville forvente at disse teknikkene bør være nyttig i mange eksperimentelle protokoller. De bør også være effektive seg på engineering romanen peptid hemmere av mange cellulære prosesser; en funksjon som kan bli ytterligere forbedret ved linkage til CPP sekvenser.

Protocol

I. Bruk av Short Peptider i Biological Analysis I.1. Fargetilordning Biologisk Funksjonelle Motifs Bruke Peptides Treating celler med Nef skannebehov peptider Fremskaffe et sett av peptider skanning regionen av interesse. For våre eksperimenter, -20 mer peptider, med ti aminosyre overlapping, som spenner over den hele HIV-1 Nef protein (205 aa), ble innhentet fra den AIDS Reagent Program. De peptider er assayed individuelt som følger: Tilsett 10 ng / ml av peptid…

Representative Results

Kartlegging biologisk funksjonelle motiver hjelp Peptider. To regioner ble identifisert på NEF-proteiner som induserer apoptose. Peptid-drevet apoptose ble observert (Figur 2) begynner med peptid N50 (AA30-50), med en topp på N60 (aa40-60) og N70 (aa50-70), og reduseres til bakgrunnsnivået på peptid N100 (aa80-100). Den store Motiv 1 (M1) topp, sentrert om aa50-60, induserer> 80% av de apoptotiske nivåer av full-lengde Nef-protein. En annen, mindre apoptose Toppen ble observert …

Discussion

Forstå de mekanismene bak Nef evne til å manipulere den exosomal trafficking pathway vil være nyttig seg på engineering romanen hemmere av exNef sekresjon. Hemming av exNef sekresjon bør redusere CD4 T-celle uttømming og CIA som driver HIV / AIDS patogenesen. Mot dette målet, har vi utviklet en rekke nye reagenser og metoder som tillater oss å analysere genetikk av exNef sekresjon, og begynne å bestemme cellulære proteiner involvert. Denne tilnærmingen førte også til utviklingen av den første inhibitor til…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
20mer peptide set with 10 amino acid overlap	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	4641
TUNEL Assay	Roche	11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent	Active Motif	30100
Tecan GENEios fluorimeter	(Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate	Corning	3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Millipore	ZTC18S096	C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF