Fototrombotisch Ischemie: Een minimaal invasieve en Reproduceerbaar Fotochemisch corticale laesie Model voor Mouse Stroke Studies

Summary

Photothrombosis is een snelle, minimaal-invasieve techniek voor het induceren van kleine en goed afgebakende infarct in gebieden die van belang zijn in zeer reproduceerbare wijze. Het is bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.

Abstract

De fototrombotisch takt model beoogt een ischemische schade binnen een bepaalde corticale gebied door middel van foto-activatie van een eerder ingespoten lichtgevoelige kleurstof induceren. Na belichting wordt de kleurstof geactiveerd en produceert singlet zuurstof schade onderdelen van endotheliale celmembranen, gevolgd bloedplaatjesaggregatie en trombi formatie, die uiteindelijk bepaalt de onderbreking van lokale doorbloeding. Deze aanpak, die aanvankelijk door Rosenblum en El-Sabban voorgesteld in 1977, werd later verbeterd door Watson in 1985 in de hersenen van de rat en stel de basis van het huidige model. Ook de toegenomen beschikbaarheid van transgene muis lijnen verder bijgedragen aan de rente op de photothrombosis model te verhogen. In het kort wordt een fotogevoelige kleurstof (Rose Bengal) intraperitoneaal geïnjecteerd en in de bloedsomloop. Wanneer verlicht door een koude lichtbron, de kleurstof wordt geactiveerd en induceert endotheliale schade met bloedplaatjes activering en trombose, wat resulteert in lokaledoorbloeding onderbreking. De lichtbron kan worden toegepast op de intacte schedel zonder de noodzaak van craniotomie, waardoor targeting van een corticaal gebied van belang in een reproduceerbare en niet-invasieve manier. De muis wordt vervolgens gehecht en toegestaan ​​om wakker te worden. De evaluatie van ischemische schade kan opgezet worden door trifenyl-tetrazoliumchloride of cresyl violet kleuring. Deze techniek levert infarct van kleine en goed afgebakende grenzen, hetgeen zeer voordelig voor nauwkeurige cel karakterisering en functionele studies. Verder is het bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.

Introduction

Aan het begin van de 21e eeuw, ischemische beroerte is een verwoestende aandoening die de tweede oorzaak van langdurige invaliditeit ¹ en de tweede oorzaak van sterfte wereldwijd, waarbij beroerte goed voor ongeveer 5,7 miljoen doden in 2004 ² vertegenwoordigt. Ondanks de vele inspanningen die in zijn gebracht, is er nog steeds geen effectieve behandeling beschikbaar functioneel herstel na een beroerte te verbeteren. Diermodellen van beroerte veel gebruikt op het gebied van slagonderzoek als zij toestaan ​​modellering van de pathofysiologie van ischemische schade en testen van de effectiviteit van verschillende neuroprotectieve strategieën in vivo. De meeste van deze modellen gericht op uitgebreide infarcten veroorzaken door het onderbreken (tijdelijk of permanent) van de bloedstroom in de arteria cerebri media, terwijl andere modellen werden ontwikkeld om letsels van kleine omvang studeren in specifieke gebieden, meestal de motor en somatosensorische cortex. Echter kunnen verscheidene factoren bijdragen aan ac genererenepaalde mate van variabiliteit in de experimentele beroerte studies, waaronder de muis gebruikte stam, de leeftijd en het geslacht van de dieren in de studie en vooral de techniek aangenomen om de ischemische schade veroorzaken. Wat dit laatste punt, de duur en de invasiviteit van de operatie (de noodzaak van een craniotomie) en de chirurgische vaardigheid vereist om de exploitant betrouwbaar induceren een ischemische laesie zijn bepalend voor een succesvolle en onpartijdige in vivo studie stroke .

Het concept van photothrombosis werd aanvankelijk door Rosenblum en El-Sabban voorgesteld in 1977 ³ en werd bekend door zijn toepassing in hersenen van de rat door Watson et al. in 1985 ^4, waarin de techniek werd grotendeels verbeterd en stel de basis van het huidige model ^{3. – 6.} De fototrombotisch aanpak heeft tot doel een corticaal infarct veroorzaken via de foto-activatie van een lichtgevoelige kleurstof eerder geleverde in bloed-systeem, which leidt tot plaatselijke vat trombose in de gebieden die zijn blootgesteld aan het licht. Wanneer de circulerende kleurstof verlicht de geschikte golflengte door een koude lichtbron, komt er energie zuurstofmoleculen, die op zijn beurt genereert een grote hoeveelheid zeer reactieve singlet zuurstof producten. Deze zuurstofradicalen induceren endotheelcellen membraan peroxidatie, waardoor bloedplaatjes adhesie en aggregatie, en uiteindelijk de vorming van trombi die lokale cerebrale te onderbreken ⁷ bepalen.

Photothrombosis is een niet-canonieke ischemische model dat niet afsluiten of breken op een slagader zoals meestal gebeurt in humane beroerte, maar induceert laesies in meer oppervlakkige vaten, waardoor selectieve onderbreking van de bloedstroom in het gebied blootgesteld aan licht. Daarom kan deze benadering geschikt voor cellulaire en moleculaire studies van corticale plasticiteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in haar eenvoud van uitvoering.Bovendien kan photothrombosis gemakkelijk worden uitgevoerd in ongeveer veertig minuten per dier, met inbegrip van twintig minuten wachten (3 min voor anesthesie; 1 min op de hoofdhuid scheren; 3 tot 5 minuten om het dier te leggen op de stereotaxische apparaat, 2 min naar het schrobben hoofdhuid met antiseptische oplossing, maken een incisie en reinig de schedel; 2 tot 4 min naar het koude licht vezel te plaatsen; 1 min naar het Bengaals oplossing te injecteren; 5 min-wachten voor intraperitoneale diffusie, 15 min van verlichting, en 5 min naar Reinig de wond en hechtdraad het dier). Voorts werd geen enkele chirurgische kennis om deze techniek presteren als de laesie wordt veroorzaakt door eenvoudige verlichting van de intacte schedel. In tegenstelling tot de klassieke arteriële occlusie, deze methode bepaalt selectieve afsluitingen van pial en intraparenchymateuze microvessels binnen het bestraalde gebied en vermindert de variabiliteit onder laesies als er geen onderpand schip wordt overgelaten aan zuurstof in het doelgebied.

Ondanks zijn bijzondere aard, defototrombotisch schade aandelen essentiële mechanismen die zich in de hersenen een beroerte. Net arteria in menselijke beroerte, bloedplaatjesaggregatie en thrombusvorming bepalen onderbreking van de bloedstroom in het bestraalde gebied ^7. Ook dit model deelt ook essentieel ontstekingsreacties zoals in midden cerebrale slagader occlusie ^8. Vanwege de goed afgebakende grenzen, de bijschaduw zone, die overeenkomt met een gebied van gedeeltelijk behouden metabolisme, zeer beperkte of onbestaande na fototrombotisch laesie. Deze duidelijke grens kan de studie van cellulaire reacties binnen ischemische of intacte corticale gebied te vergemakkelijken. Photothrombosis muismodel is bijzonder geschikt voor slag studies in verschillende transgene dieren. Inderdaad klassieke modellen kunnen niet geschikt om alle spanningen en een lange periode onderzoeken in C57BL / 6 muizenstam meldde een hoge mortaliteit verhouding die vooringenomenheid ⁹ kan veroorzaken.

Protocol

1. Pre-operatie Weeg Rose Bengal in een 1,5 ml buis en opgelost in steriele zoutoplossing tot aan een uiteindelijke concentratie van 15 mg / ml. Filter steriliseer door een 0,2 urn filter en opslaan in het donker bij kamertemperatuur tot twee maanden. Steriliseren alle chirurgische instrumenten in de autoclaaf. De chirurgische gebied moet minder dan een uur worden opgeschoond alvorens de operatie. Noteer het lichaamsgewicht van de muis om de dosis van Rose Bengal in te spuiten passen. We g…

Representative Results

Dit protocol is een corticale laesie die is al zichtbaar na dissectie van de cortex met het blote oog (Figuren 1A-1C) produceren. De fototrombotisch laesie ontwikkelt zich in oppervlakkige en diepe corticale lagen waarbij het weefsel voldoende doorzichtig om foto-activatie van de Bengaals toestaan. Meting van de omvang van herseninfarct kan snel worden uitgevoerd door histologische kleuring met trifenyl-tetrazoliumchloride (TTC) in vers weefsel of cresylviolet na fixatie in 4% paraformaldehyde (PFA). Vo…

Discussion

Wijzigingen en vervangingen

Vanwege de absorptie piek bij 562 nm, werd een groen licht laser uit een gefilterde xenon booglamp oorspronkelijk gekozen om de lichtgevoelige Bengaals bestralen. Hoewel laser-gemedieerde excitatie werd nog gebruikt recently5, kan het worden vervangen door koud licht lamp die er ook voor zorgen kleurstof excitatie ^10,15. Koud licht optische vezels zijn gemakkelijker te manipuleren en minder duur dan laserbronnen. Er moet opgemerkt worden dat lasers algemee…

Materials

MATERIAL NAME	COMPANY	CATALOGUE NUMBER
			Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
			Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made