Isolation der Native Soil Mikroorganismen mit Potenzial für den Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoff Mulch Films in der Landwirtschaft eingesetzt

Summary

Kunststoff-Folien mit der Bezeichnung "biologisch abbaubar" sind im Handel erhältlich für die landwirtschaftliche Nutzung als Mulch. Bodenbearbeitung stellt eine attraktive Methode zur Verfügung, aber Abbau unter Feldbedingungen ist wenig bekannt. Der Zweck dieser Studie war es, Methoden zur Isolierung von Mutterboden Pilze und Bakterien, die Plastik Mulchfolien nach Feld Bestattung kolonisieren zu entwickeln.

Abstract

Fungi heimisch landwirtschaftlichen Böden, die im Handel erhältlichen biologisch abbaubaren Mulch (BDM) Filme kolonisiert wurden isoliert und auf eine mögliche Potenzial, Kunststoffe zersetzen. Normalerweise, wenn Formulierungen von Kunststoffen bekannt sind und eine Quelle des Ausgangsmaterials vorhanden ist, kann pulverförmigen Kunststoff in Agar-basierten Medien-und Abbau durch Visualisierung von Clearing-Zonen bestimmt ausgesetzt werden. Doch dieser Ansatz schlecht imitiert in situ Abbau von BDMs. Zuerst werden BDMs nicht als kleine Teilchen durch den Boden dispergiert. Zweitens werden BDMs nicht im Handel als reine Polymere erhältlich, sondern als Folien, die Zusätze (z. B. Füllstoffe, Weichmacher und Farbstoffe), die das mikrobielle Wachstum beeinflussen können. Die hier beschriebenen Verfahren wurden Isolate aus Boden vergraben Mulchfolien erworben werden. Pilz-Isolate aus ausgegraben BDMs erworben wurden einzeln für Wachstum auf einem Stück neue, entwesten BDMs oben definierten Medium ohne Kohlenstoffquelle e festgelegten getestetXCEPT Agar. Isolate, die auf BDMs wuchsen, wurden weiter in einem flüssigen Medium, wo BDMs waren die einzige hinzugefügt Kohlenstoffquelle getestet. Nach etwa zehn Wochen wurden Pilzbesiedlung und BDM Abbau durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Isolate wurden durch eine Analyse der ribosomalen RNA-Gen-Sequenzen identifiziert. Dieser Bericht beschreibt die Methoden zum Pilz isoliert, sondern auch Bakterien isoliert wurden mit diesen Methoden durch Einsetzen geeigneter Medien für Bakterien. Unsere Methodik sollte sich als nützlich erweisen für Studien, die Aufschlüsselung der intakten Kunststofffolien oder Produkte, für die Kunststoff-Rohstoffe sind entweder unbekannt oder nicht verfügbar. Doch unser Ansatz nicht ein quantitatives Verfahren zum Vergleich von Preisen BDM Abbau.

Introduction

Der Abbau ist historisch betrachtet worden eine unerwünschte Eigenschaft von Kunststoff-Polymere, weil Aufschlüsselung verkürzt Produkt Lebensdauer und Haltbarkeit. Vor kurzem hat das Bewusstsein für die Umweltprobleme durch Plastikmüll in der natürlichen Umgebung präsentiert ^1,2,3 gemacht biologisch abbaubare Kunststoffe eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Kunststoffen. Degradation (definiert als strukturelle Veränderungen, Fragmentierung und Reduktion im Molekulargewicht, Integrität und Stärke ^4,5) erfolgt über eine Reihe von Veranstaltungen, darunter sowohl abiotische Prozesse (thermische Belastung, Photo-Oxidation, Hydrolyse, Erosion und mechanischer Belastung), und biologischen Abbau ^6. Während abiotische Prozesse das Fragment Größe und die Eigenschaften von Kunststoffen verändern können, sind Mikroorganismen für ihre ultimative Mineralisierung zu Wasser und Kohlendioxid (unter aeroben Bedingungen) und / oder Methan (unter anaeroben Bedingungen) erforderlich.

Eine wesentliche Nische fürbiologisch abbaubare Kunststoffe gibt es in der Landwirtschaft, wo Kunststoff Mulch verwendet werden, um Unkraut zu verhindern, um die Bodenfeuchtigkeit zu erhalten und zu erhöhen Bodentemperaturen ^7,8. Hunderttausende von Hektar in den Vereinigten Staaten allein sind mit Kunststoff Mulch ^9, einschließlich Mulch aus biologisch abbaubarem Kunststoff abgedeckt. Nach einer Ernte Vegetationsperiode, sind die Optionen für die Entsorgung von biologisch abbaubaren Mulch (BDM) Entsorgung in einer Deponie, Verbrennung zur Energierückgewinnung ^10, Abbau über Kompostierung oder Abbau im Boden nach Bodenbearbeitung ^11. Von diesen sind die wenigsten arbeitsintensive Schicksal Pflügen BDMs in den Boden, aber ohne effizienten Abbau und Mineralisierung während der Nicht-crop Monate (in der Regel im Winter), konnte Kunststoff Fragmente bleiben und stören Landmaschinen im Frühjahr Bodenbearbeitung und Pflanzung, und verbleiben in der Umwelt, wo sie erhebliche Auswirkungen auf Wildtiere, Pflanzen und microbiota ^1,2,3,10.

<p class = "jove_content"> Obwohl viele Kunststoff-Produkte, einschließlich der landwirtschaftlichen Mulchfolien, tragen die Bezeichnung "biologisch abbaubar" oder "kompostierbar", in der Praxis, Abbau und Mineralisierung möglicherweise zu ineffizient und / oder zu unvollständig für in-Boden-Zersetzung zu sein ein Alternative für die Entsorgung dieser Produkte. Zum Beispiel erreicht oxo-biologisch abbaubare Polyethylene nur 12,4% Mineralisierung nach einem Jahr der Verwitterung und die drei darauf folgenden Monaten in einem 58 ° C Kompost, und weniger als die Hälfte dieses Betrages der Mineralisierung, wenn der Kompost Temperatur betrug 25 ° C ¹² aufgetreten. Im Winter würde Bodentemperaturen an den meisten Standorten niedriger sein als entweder von diesen Temperaturen, vermutlich was zu noch niedrigeren mikrobielle Aktivität und folglich weniger Mineralisierung. Neben Abbauraten verlangsamen, hat Missbrauch des Begriffs "biologisch abbaubar" zu misstrauen dieser Produkte durch die Verbraucher ^13,14, einschließlich der in der Landwirtschaft geführt. Biologischer Abbau ist die Umwandlungvon Polymeren zu Kohlendioxid (und / oder Methan) und Wasser ¹⁴ durch natürlich vorkommende Mikroorganismen ^4. Daher müssen biologischen chemisch gemessen werden, die körperliche Vereinigung von Mikroorganismen mit einem Substrat bedeutet nicht, mikrobiellen Abbau dieses Materials.

Als Teil der Bemühungen um eine nachhaltige Nutzung von BDMs in der Landwirtschaft untersuchen, diese Studie auf die Entdeckung Mikroorganismen stammt aus landwirtschaftlichen Böden, die sie besiedeln und zersetzen handelsüblichen BDMs konzentriert. Standard-Prüfverfahren wurden für chemisch Messung der Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoffen durch abiotische und biologische Mittel ^15,16,17 veröffentlicht. Allerdings sind diese Methoden nicht auf Abbau von Kunststoffen durch individuelle mikrobielle Spezies, oder stellen Methoden für ihre Isolation. Die Methodik hierin ähnelt mehr Standard-Methoden entwickelt, um Kunststoffe für die Resistenz gegen mikrobiellen Abbau nach Impfen Proben mit Pilzsporen bewerten18,19.

Wenn Formulierungen von Kunststoffen bekannt sind und eine Quelle des Ausgangsmaterials vorhanden ist, kann pulverförmigen Kunststoff in Agar-basierten Medien-und Abbau durch Visualisierung von Clearing-Zonen ¹³ bestimmt ausgesetzt werden. Diese Methode wurde bereits von Mikroorganismen, dass Polymere wie Polyurethan ²⁰ verschlechtern, Poly (butylensuccinat-co-adipat) ²¹ und Poly (Milchsäure) ²² zu identifizieren. Ein ähnliches Verfahren beinhaltet das Suspendieren reinen pulverförmigen Kunststoff in flüssigem Medium, in dem der Kunststoff die einzige Kohlenstoffquelle ^20,23. Während diese Verfahren den Vorteil einer definierten System haben, sie schlecht zu imitieren in situ Abbau von BDMs. Zuerst wird die Oberfläche anders, weil BDMs nicht in kleine Teilchen durch den Boden dispergiert sind, sondern, verkauft und verwendet wie Folien verteilt. Zweitens ist die chemische Zusammensetzung von BDMs aus reinem Polymeren. BDMs enthalten in der Regel Additive, wieFüllstoffe, Weichmacher und Farbstoffe, und diese Additive beeinflussen kann mikrobielles Wachstum und damit die Geschwindigkeit der Mineralisierung. Aus diesem Grund, und weil die Zusammensetzung bestimmter kommerzielle Filme in dieser Studie waren proprietär, Kunststoff-Folie in diesem Bereich bereits Form wurde verwendet, um Pilze und Bakterien zu isolieren. Der Einfachheit halber werden die folgenden Methoden nur für Pilze beschrieben, mit Änderungen hingewiesen gegebenenfalls für bakterielle Isolierungen.

In einer aktuellen Studie ²⁴ wurden drei kommerziell erhältlichen BDMs und ein experimenteller Film auf landwirtschaftlichen Standorten in drei verschiedenen Regionen der Vereinigten Staaten für eine Vegetationsperiode, und anschließend in mesh (250 Mikrometer) Taschen gelegt und begraben für einen Winter im Boden an den gleichen Standorten. Die 250 micron Maschen erlauben Pilzhyphen zu durchdringen, während ohne Wurzeln und die meisten Bodenfauna und der Minimierung der Eingriffe Boden ^25,26. Nylon Materialien zu verhindern Beutel Abbau im Boden. Nach Aushub, fungal Isolate wurden vom BDM Stücke gewonnen und beurteilt für Wachstum auf Minimalmedium ohne Kohlenstoffquelle außer dem Agar und einem 5 cm x 5 cm Oberfläche desinfiziert Quadrat neu, unbenutzt BDM Film, der pre-entwesten war. Die meisten Kunststoffe wie Folien nicht ohne Verlust der Integrität autoklaviert werden, so wurde UV-Licht verwendet werden, um mikrobielle Zellen, die sich auf die Kunststoff töten. ISO 846 ¹⁹ empfiehlt Oberfläche Entwesung in 70% Ethanol und anschließender Trocknung, aber wenn mit dieser Methode, muss man sicherstellen, dass keine Komponente oder Zusatzstoff des Films negativ wird von der Ethanol betroffen. Seit BDMs vermutlich hergestellt von Sonnenlicht zu widerstehen, wurde UV als Dekontaminationsmethode gewählt.

Isolate, die auf BDM Stück besser als auf Minimalmedium alleine wuchsen, wurden zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Agar, ein Polysaccharid durch Meeresalgen produziert, wird verwendet, um mikrobielle Medien verfestigen, da es in der Regel nicht genutzt metabolisch von landwirtschaftlich und medizinisch nichtkönnen Mikroorganismen, jedoch haben Agar-Hydrolyse Enzyme aus marinen Bakterien ²⁷ und Agar-Hydrolyse Bakterien haben auch aus dem Boden ²⁸ isoliert isoliert worden. BDM Polymeren und Agar sowohl erwartet seltenen Substrate für Enzyme, die durch Boden-Pilze, die in Umgebungen, in denen diese Polymere als potentielle Nährstoffquellen enthalten entwickelt haben sezerniert werden, aber beide Substrate sind in der Platte Bioassay hier (Schritt 7). Pilze, die BDMs aber nicht Agar verwenden als Kohlenstoffquelle aus Pilzen, die Agar verwenden nur unterschieden werden, indem das Wachstum auf Agar-verfestigtem Medium, enthaltend i) keinen zusätzlichen Kohlenstoffquelle außer Agar (negative Kontrolle), ii) BDM Filme (experimentell) und iii) Glucose (positive Kontrolle). Wachstum der Isolate auf Minimalmedium mit Glukose erwartet; Pilze nicht entstehende Glucose-enthaltenden Platten möglicherweise nicht in der Lage ist Wachstum auf dem bestimmten Minimal-Medium in dem Experiment verwendet. Potential BDM Abbauern sollte auf Agar verfestigten Minimalmedium + BDM Film besser als sie auf Agar verfestigten Minimalmedium wachsen allein wachsen. Pilze wachsen auf Minimalmedium Platten sind Agar-Abbauern oder oligotrophs und werden voraussichtlich auch auf dem Agar mit BDM Filme in Bioassay Platten verbunden wachsen, aber nicht auf die Filme selbst (es sei denn, sie glücklicherweise auch verschlechtern BDM Polymere).

Um die Möglichkeit zu sehen, das mikrobielle Wachstum durch die Nutzung von Agar und nicht die von BDMs beseitigen, folgten wir unseren ersten Test zum BDM Kolonisation auf Agar-Platten mit einem Biotest in definierten Brühemedium (Schritt 9). BDM Stücke repräsentiert die einzige bekannte Kohlenstoffquelle in dem Bioassay Rohre.

Nach dem ersten Screening und auf die Wiederbelebung Glycerin Aktien der Isolate, einige knappe, aber sichtbare Myzel in flüssigem Medium, das definiert keine bekannte Kohlenstoff-Quelle gebildet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass einige der erworbenen Isolate waren oligotrophs – Organismen, die durch Abfangen sehr geringe Mengen an Kohlenstoff, Stickstoff und andere Nährstoffe, entweder in der wässrigen Umgebung oder bestehenden flüchtigen in der Luft gelöst ^29,30,31 wachsen. Species Identifizierung über 18S ribosomalen DNA-Analyse unterstützt diese Ansicht, da viele der Isolate abgestimmt Pilzgattungen zuvor berichtet Oligotrophie ³² ausstellen. Oligotrophs, die gewöhnlich sind saprophytes erfordern ein breites Spektrum von metabolischen Funktionen für die Nutzung Substrat in einem Bereich von ³⁰ Umgebungen. So ist es nicht verwunderlich, dass wir die gleichen Pilze isoliert von BDMs (vermutlich erfordern ungewöhnliche enzymatischen Fähigkeiten) nährstoffarmen Kapazitäten demonstriert und konnten sich auf Spurenstoffe wie Hautfett vor Fingerabdrücken, Staub oder flüchtige Spuren in der Luft wachsen. Durch die Isolierung von oligotrophs schlossen wir, dass das Wachstum auf einer BDM Oberfläche allein nicht verwendet werden, um BDM Aufschlüsselung abzuleiten. Die hier beschriebenen Verfahren beziehen sich auf unsere Bemühungen, screen nativen BDM Kolonisatoren aus landwirtschaftlichen Böden für bona fide BDM Zusammenbruch.

Protocol

Dieses Verfahren erfordert mindestens mehrere Monate für die Inkubation von BDM Filme im Boden, und mehrere Monate für sequentielle Bioassays sowohl auf Agar-Platten und Agar-frei, chemisch definierten Brühe Kolonisation und Abbau zu bewerten. Die einzelnen Methoden werden in der Reihenfolge, wie sie durchgeführt werden aufgelistet. 1. Inkubation von BDM Films im Boden Integrieren BDM Filme in den Boden unter Bedingungen imitiert diejenigen, unter denen sie erw…

Representative Results

In einer aktuellen Studie 24, repliziert jeweils vier von drei kommerziell erhältlichen BDMs Bezeichnung "biologisch abbaubar", sowie einen experimentellen Film und eine herkömmliche Kunststoff-Kontrolle wurden über Boden als Mulch für Tomaten-Produktion im Frühjahr 2010 gelegt in Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, und Lubbock, TX. Im Herbst 2010 wurden BDM Film Quadrate von jeweils verwitterten Mulch in vier replizieren Grundstücke geschnitten und Mutterboden wurde aus direkt unter dem Bereich,…

Discussion

Die hier beschriebene Verfahrensweise stellt einen First-Pass-Technik zur Isolierung von potenziellen BDM Abbauern aus dem Boden und wurde erfolgreich eingesetzt, um Pilze aus BDMs im Boden für sieben Monate begraben isolieren. Fungi wuchs, als auf frische BDM Material des gleichen Typs überimpft, das anzeigt, dass die isolierten Pilzen Tat waren Kolonisatoren, und daß die Filme waren nicht hemmend für Pilzwachstum. Isolation von Kunststoff-abbauende Pilze und Bakterien könnten potenziell ihre Verwendung führen, e…

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents