Samsvarende Mikroskopi for 3D Structural Analysis of Dynamic Interaksjoner
Summary
Vi beskriver en samsvarende mikroskopi metode som kombinerer høyhastighets 3D live-cell fluorescerende lys mikroskopi og høy oppløsning Cryo-elektron tomografi. Vi demonstrerer evnen til correlative metoden ved bildebehandling dynamisk, små HIV-1 partikler i samspill med host Jakten celler.
Abstract
Cryo-elektron tomografi (cryoET) kan 3D visualisering av cellulære strukturer på molekylært oppløsning i en nær-til-fysiologisk tilstand en. Imidlertid er direkte visualisering av individuelle virale komplekser i deres vert cellulære miljø med cryoET utfordrende 2, på grunn av den uvanlige og dynamiske natur av viral inngang, særlig i tilfellet med HIV-1. Mens time-lapse live-cell imaging har gitt en god del informasjon om mange aspekter av livet syklus av HIV-1 3-7, oppløsningen gis av live-cell mikroskopi er begrenset (~ 200 nm). Vårt arbeid var rettet mot å utvikle en sammenheng metode som tillater direkte visualisering av tidlige hendelser av HIV-1-infeksjon ved å kombinere live-cell fluorescerende lys mikroskopi, Cryo-fluoriserende mikroskopi, og cryoET. På denne måte kan leve-celle og kryo-fluorescerende signaler brukes til å nøyaktig styre prøvetakingen på cryoET. Videre strukturell informasjon innhentet fra cryoET kan be supplert med de dynamiske funksjonelle data innhentet gjennom live-cell imaging av fluorescerende merket målet.
I denne videoen artikkelen gir vi detaljerte metoder og protokoller for strukturell undersøkelse av HIV-1 og vert-celle interaksjoner med 3D trene seg høyhastighets live-cell bildebehandling og høy oppløsning cryoET strukturell analyse. HeLa-celler infisert med HIV-1 partikler ble først karakterisert ved konfokal mikroskopi levende celle, og regionen som inneholder den samme viruspartikkelen ble deretter analysert ved kryo-elektron tomografi for 3D strukturelle detaljer. Korrelasjonen mellom to sett av imaging data, optisk bildebehandling og elektron bildebehandling, ble oppnådd ved hjelp av en hjemme-bygget Cryo-fluorescens lysmikroskopi scenen. Tilnærmingen detaljert her vil være verdifull, ikke bare for studier av virus-vert celle interaksjoner, men også for bredere anvendelse i cellebiologi, for eksempel cellesignalisering, membran reseptor menneskehandel, og mange andre dynamiske cellulære prosesser. </ P>
Introduction
Cryo-elektron tomografi (cryoET) er en kraftig bildebehandling teknikk som gjør tredimensjonal (3D) visualisering av celler og vev, og gir innsikt i organiseringen av innfødte organeller og cellulære strukturer på molekylært oppløsning i en nær-til fysiologisk tilstand en. Imidlertid gjør den iboende lav kontrast av unstained frosset hydrert prøven, kombinert med deres stråling følsomhet, er det vanskelig å lokalisere områder av interesse inne i en celle og deretter utføre den vippbare serie med hell uten å skade målområdet. For å overvinne disse problemer, er en samsvarende fremgangsmåte som kombinerer lys-og elektronmikroskopi er nødvendig. Spesifikke funksjoner markert med fluorescerende merking er identifisert og lokalisert ved fluorescens lysmikroskopi, og deretter deres koordinater overføres til elektronmikroskop for erverv av høyoppløselige 3D strukturelle data. Denne trene seg metoden hjelper lokalisere målet enreas av interesse tas opp. På grunn av begrensning på prøven tykkelse med cryoEM (<300 nm), for tiden bare de perifere delene av cellen er egnet for 3D strukturell analyse av CryoET. Ytterligere redusere tykkelsen av frossen-hydrert eksemplarer av glasslegemet seksjonering 8 eller ved Cryo-fokusert ion stråle (FIB) fresing 9 vil utvide evnen til correlative bildebehandling.
Tidligere ble samsvarende metoder primært brukes til å forenkle cryoET datainnsamling for store og statiske strukturer 10-13. I disse studiene har Cryo-etapper er iverksatt for å akseptere cryoEM nett og passe på enten en oppreist mikroskop eller en invertert mikroskop 10,11,14. Selv bytter nett virker ganske grei i sine design, er det ekstra overføring trinn involvert for EM rutenett, øker sjansen for at nettet kan bli deformert, skadet og forurenset. Vi har nylig demonstrert en teknisk fremskritt icorrelative mikroskopi som tillater oss å direkte visualisere dynamiske hendelser som er av natur vanskelig å fange, slik som HIV-1 og vert celle interaksjoner på tidlige stadier av infeksjon 15. Vi oppnådd dette ved å designe og implementere en Cryo-lysmikroskopi prøven scenen som tilpasser en patron system for å minimere prøven skade på grunn av rutenett håndtering, og dermed tilrettelegge for korrelasjon. Vår design inkluderer en integrert eksemplar kassettholderen, slik at både Cryo-lys og Cryo-elektron mikroskopi som skal utføres, sekvensielt, på samme prøven holder, uten sample overføring, og dermed effektivisere den samsvarende prosessen. I tillegg har vi også implementert en nøyaktig og pålitelig korrelasjon prosedyren ved hjelp av fluoriserende latekskuler som fiducial markører.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presentert en grei sett med protokoller for å gi en avansert samsvarende tilnærming til å analysere dynamiske cellulære hendelser ved hjelp av time-lapse confocal, live-cell fluorescens bildebehandling etterfulgt av cryoET. Vår metodeutvikling å korrelere 3D live-cell bildebehandling med høy oppløsning cryoET er kritisk å undersøke mange utfordrende biologiske problemer, for eksempel visualisere sjeldne, dynamiske (ikke statisk, som tidligere meldt), og diffraksjon begrenset viruspartikler og deres sams…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Travis Wheeler og maskinen butikken ved Institutt for cellebiologi og fysiologi, Universitetet i Pittsburgh for byggingen av Cryo-fluorescens prøven scenen, Changlu Tao og Cheng Xu ved University of Science and Technology i Kina for teknisk assistanse, og Dr. Teresa Brosenitsch for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
