الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية
Summary
نحن تصف طريقة المجهر المتلازم الذي يجمع بين السرعة العالية 3D الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت وعالية الدقة البرد الإلكترون التصوير المقطعي. علينا أن نظهر قدرة أسلوب مترابط عن طريق التصوير الديناميكي، صغيرة HIV-1 جزيئات التفاعل مع خلايا هيلا المضيف.
Abstract
البرد الإلكترون التصوير المقطعي (cryoET) يسمح التصور 3D من الهياكل الخلوية الجزيئية في القرار في حالة إغلاق إلى الفسيولوجية 1. ومع ذلك، والتصور المباشر من المجمعات الفيروسية الفردية في بيئة المضيفة الخلوية مع cryoET يتحدى 2، نظرا لطبيعة نادرة وديناميكية من دخول الفيروس، وخاصة في حالة HIV-1. بينما الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية قد حقق قدرا كبيرا من المعلومات حول العديد من جوانب دورة حياة HIV-1 3-7، القرار التي يوفرها المجهري الخلية الحية محدودة (~ 200 نانومتر). ويهدف عملنا في تطوير طريقة الارتباط الذي يسمح التصور مباشرة من الأحداث في وقت مبكر من HIV-1 العدوى عن طريق الجمع بين الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت، المجهري البرد الفلورسنت، وcryoET. في هذه الطريقة، وإشارات الخلية الحية والبرد الفلورسنت يمكن استخدامها لتوجيه بدقة أخذ العينات في cryoET. وعلاوة على ذلك، تم الحصول عليها من المعلومات الهيكلية cryoET يمكن به تستكمل مع البيانات الديناميكية الوظيفية المكتسبة من خلال التصوير الخلية الحية من الفلورسنت الهدف المسمى.
في هذه المقالة الفيديو، ونحن نقدم أساليب وبروتوكولات وإجراءات تفصيلية للتحقيق الهيكلية للHIV-1 والتفاعلات المضيف الخلية باستخدام 3D المتلازم عالية السرعة التصوير الخلية الحية وعالية الدقة cryoET التحليل البنيوي. وتميزت خلايا هيلا المصابين HIV-1 الجسيمات الأولى التي متحد البؤر المجهري الخلية الحية، والمنطقة التي تحتوي على نفس الجسيمات الفيروسية ثم تم تحليلها من قبل البرد الإلكترون التصوير المقطعي للحصول على التفاصيل الهيكلية 3D. وقد تحقق الارتباط بين مجموعتين من البيانات والتصوير، والتصوير الضوئي والتصوير الإلكترون، وذلك باستخدام البرد مضان ضوء المرحلة المجهري محلي الصنع. فإن نهج مفصل هنا تكون ذات قيمة، ليس فقط لدراسة التفاعلات الخلية المضيفة الفيروس، ولكن أيضا لتطبيقات أوسع في بيولوجيا الخلايا، مثل الخلايا مما يشير، والاتجار مستقبلات الغشاء، والعديد من العمليات الخلوية الحيوية الأخرى. </ P>
Introduction
البرد الإلكترون التصوير المقطعي (cryoET) هي تقنية التصوير القوية التي تسمح ثلاثي الأبعاد (3D) التصور من الخلايا والأنسجة، ويقدم نظرة ثاقبة لتنظيم العضيات المحلية والهياكل الخلوية في القرار الجزيئية في وثيقة إلى الحالة الفسيولوجية 1. ومع ذلك، وعلى النقيض منخفضة بطبيعتها من غير ملوثين العينة المجمدة رطب، جنبا إلى جنب مع حساسية للإشعاع، ويجعل من الصعب تحديد المجالات ذات الاهتمام داخل الخلية وأداء لاحقا إلى سلسلة الميل بنجاح دون الإضرار المنطقة المستهدفة. من أجل التغلب على هذه المشاكل، واتباع نهج مترابط يجمع بين الضوء والمجهر الإلكتروني هو ضروري. ويتم تحديد السمات المحددة التي أبرزها وضع العلامات الفلورية وتقع بواسطة المجهر الضوئي مضان، وبعد ذلك يتم نقل الإحداثيات الخاصة بها إلى المجهر الإلكتروني لاقتناء القرار البيانات الهيكلية عالية 3D. هذا الأسلوب المتلازم يساعد تحديد مكان وجود الهدف كانREAS من الفائدة التي يتعين معالجتها. ونظرا لقيود على سماكة العينة مع cryoEM (<300 نانومتر)، حاليا فقط المناطق الطرفية من الخلية هي مناسبة لتحليل الهيكلية 3D بواسطة CryoET. سوف يزيد من تقليل سماكة من العينات المجمدة رطب بواسطة زجاجي باجتزاء 8 أو البرد تركز أيون شعاع (FIB) صفائح 9 توسيع نطاق قدرات التصوير مترابط.
سابقا، كانت تستخدم أساليب المتلازم في المقام الأول إلى تسهيل الحصول على البيانات cryoET لهياكل كبيرة وثابتة 10-13. في هذه الدراسات، تم تنفيذ البرد مراحل لقبول شبكات cryoEM وتناسب وضعها إما المجهر تستقيم أو مجهر مقلوب 10،11،14. على الرغم من التحول شبكات يبدو اضحة إلى حد ما في تصاميمهم، وهناك نقل إضافية الخطوات المتبعة للحصول على الشبكة EM، مما يزيد من فرصة أن الشبكة قد تكون مشوهة، وتلف والملوثة. ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت تقدما في التقنيةالمجهر المتلازم الذي يسمح لنا لتصور الأحداث مباشرة الديناميكية التي هي بطبيعتها صعبة لالتقاط الصور، مثل HIV-1 والتفاعلات الخلية المضيفة في المراحل المبكرة من العدوى 15. نحن إنجاز هذا من خلال تصميم وتنفيذ نموذج المجهري البرد على ضوء المرحلة التي تتكيف مع نظام خرطوشة لتقليل الضرر العينة بسبب طريقة تعامل الشبكة، مما يسهل الارتباط. لدينا تصميم متكامل يتضمن حامل خرطوشة العينة، السماح لكلا المجهري البرد الخفيفة والبرد الإلكترون التي يتعين القيام بها، بالتتابع، على نفس صاحب العينة، من دون نقل العينة، وبالتالي تبسيط عملية مترابط. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا تنفيذ إجراء دقيقة وموثوق بها علاقة باستخدام الخرز اللاتكس فلوري كعلامات إيمانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قدمنا مجموعة واضحة من البروتوكولات لتوفير نهج مترابط متقدمة لتحليل الأحداث الخلوية الديناميكية باستخدام الوقت الفاصل بين متحد البؤر، والتصوير مضان الخلية الحية تليها cryoET. لدينا التطوير المنهجي لربط 3D التصوير الخلية الحية مع عالية الدقة cryoET أمر بالغ الأهمية…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر ترافيس يلر ورشة ميكانيكا في قسم بيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء في جامعة بيتسبرغ لبناء المرحلة عينة البرد مضان، تشانغ لو تاو وتشنغ شو في جامعة العلوم والتكنولوجيا في الصين لأسباب تقنية المساعدة، والدكتور تيريزا Brosenitsch لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM082251 وGM085043).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
