相关显微镜的动力相互作用的三维结构分析
Summary
我们描述了相关显微镜方法，结合高速的3D活细胞荧光显微镜和高分辨率低温电子断层扫描。我们的相关方法，小HIV-1颗粒与宿主相互作用的HeLa细胞成像动态演示的能力。
Abstract
低温电子断层扫描（cryoET）允许蜂窝结构的三维可视化分子分辨率在接近生理状态1。然而，直接可视化的个别病毒复合物在宿主细胞环境与cryoET是具有挑战性的，由于病毒进入的偶发性和动态特性，特别是在HIV-1的情况下。虽然时间推移活细胞成像已经取得了很大的许多方面的信息生命周期的HIV-1 3-7，所提供活细胞显微镜的分辨率是有限的（约200纳米）。我们工作的目的是允许直接可视化的HIV-1感染的早期事件的相关方法相结合，活细胞荧光光学显微镜，低温荧光显微镜，cryoET的发展。在这种方式下，活细胞和低温荧光信号可以被用来准确地引导在cryoET采样。此外，结构从cryoET可以得到的信息ê辅以动态功能数据获得通过活细胞成像的荧光标记的目标。
在这个视频文章中，我们提供了详细的方法和协议结构的研究HIV-1和宿主细胞的相互作用，使用3D相关高速活细胞成像和高分辨率cryoET的结构性分析。 HeLa细胞感染HIV-1的颗粒，其特征在于第一活细胞共聚焦显微镜，并含有相同的病毒颗粒的区域，然后通过低温电子断层扫描三维结构的细节。使用两套成像数据，光学成像和电子成像之间的相关性达到了一个家庭建造的低温荧光光学显微镜阶段。这里详细的做法将是有价值的，不仅为研究病毒宿主细胞的相互作用，同时也为在细胞生物学的更广泛的应用，如细胞信号传导，膜受体贩运，和许多其他动态细胞过程。/ P>
Introduction
低温电子断层扫描（cryoET）是一个功能强大的成像技术，可以使细胞和组织的三维（3D）的可视化，并提供洞察组织在接近生理状态1的原生细胞器和细胞结构分子分辨率。然而，固有的低对比度冷冻水合未染色的标本，结合其辐射敏感性，使得它很难感兴趣的区域的单元格内，并随后执行倾斜系列的不破坏目标区域的情况下成功。为了克服这些问题，相关的方法，结合光学和电子显微镜是必要的。强调的荧光标记的特定的功能是确定和荧光光镜位于，然后它们的坐标被传输到采集的高分辨率三维结构数据的电子显微镜。此相关方法有助于定位目标相对的利益加以解决。由于与冷冻蚀刻电镜（小于300 nm）对样品厚度的限制，目前仅在小区的周边区域是合适的三维结构分析CryoET的。由冷冻水合标本的厚度进一步减少玻璃体切片或冷冻聚焦离子束（FIB）铣9将扩大相关成像能力。
此前，相关的方法进行主要用于促进cryoET数据采集，大和静态结构10-13。在这些研究中，低温阶段已经实施，接受冷冻蚀刻电镜电网和适合到一个堂堂正正的显微镜倒置显微镜10,11,14。虽然开关网格似乎相当简单，在他们的设计中，还有额外的步骤为EM网格传输，提高电网可能会变形，损坏和污染的机会。我们最近展示了技术的进步相关显微镜，使我们能够直接可视化动态本质上是很难捕捉到的事件，如HIV-1和宿主细胞的相互作用，在感染的早期阶段15。我们做到了这一点，设计和实施低温光镜样品阶段，适应的盒系统，以尽量减少由于网格处理的试件破坏，从而促进相关。我们的设计包括一个集成的试样盒保持器，使冷冻光低温电子显微镜进行，顺序，在相同的试样夹持器，没有样品的传输，从而简化相关工艺。此外，我们还实施了准确，可靠的相关程序，使用荧光乳胶珠作为基准标记。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们已经提出了一个简单的协议，提供了先进的方法来分析相关动态的细胞活动，使用时间推移共聚焦活细胞荧光成像由cryoET其次。 3D活细胞成像高分辨率cryoET的关联我们的方法学的发展是至关重要的调查许多具有挑战性的生物学问题，如可视化与宿主细胞的罕见的，动态的（不是一成不变的，如前期报告），衍射极限的病毒粒子及其相互作用。在活细胞中的特定颗粒的空间和时间的行为，通过?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
笔者想感谢特拉维斯·惠勒和细胞生物学系的机加工车间，生理学，美国匹兹堡大学的低温荧光样品阶段，长芦涛和徐诚在中国科学技术大学建设的技术帮助和批判性阅读的手稿的邓丽君Brosenitsch博士。这项工作是由美国国立卫生研究院（GM082251 GM085043）的支持。
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
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