Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions
Summary
We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.
Abstract
Cryo-electron tomography (cryoET) maakt het mogelijk 3D-visualisatie van cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een close-to-fysiologische toestand 1. Echter, directe visualisatie van individuele virale complexen in hun gastheer cellulaire omgeving met cryoET 2 is uitdagend, gezien de lage frequentie en de dynamische aard van virale binnenkomst, met name in het geval van HIV-1. Terwijl de time-lapse live cell imaging veel informatie over de vele aspecten van de levenscyclus van HIV-3-07 januari heeft opgeleverd, de resolutie wordt geboden door levende cellen microscopie is beperkt (~ 200 nm). Ons werk is gericht op het ontwikkelen van een correlatie methode die directe visualisatie van de vroege gebeurtenissen van HIV-1 infectie toelaat door het combineren van levende cellen fluorescerend licht microscopie, cryo-fluorescentie microscopie, en cryoET. Op deze wijze kunnen levende cellen en cryo-fluorescente signalen worden gebruikt voor het nauwkeurig geleiden van de bemonstering in cryoET. Bovendien, structurele informatie uit cryoET kunnen be aangevuld met de dynamische functionele data verkregen door middel van live-cell imaging van fluorescent gelabelde doelwit.
In deze video artikel, bieden we gedetailleerde methoden en protocollen voor structurele onderzoek van HIV-1 en gastheer-cel interacties met behulp van 3D correlatieve high-speed Live-cell imaging en hoge-resolutie cryoET structurele analyse. HeLa-cellen geïnfecteerd met HIV-1 deeltjes werden eerst gekenmerkt door confocale microscopie van levende cellen, en het gebied dat dezelfde virale deeltje werd vervolgens geanalyseerd met cryo-electron tomografie voor 3D structurele details. De correlatie tussen de twee reeksen van beeldgegevens, optische beeldvorming en elektronen imaging, werd bereikt met behulp van een zelfgebouwde cryo-fluorescentie lichtmicroscopie podium. De aanpak die hier beschreven zal waardevol zijn, niet alleen voor studie van virus-gastheercel interactie, maar ook voor bredere toepassing in celbiologie, zoals signaaltransductie, receptor membraan handel, en vele andere dynamische cellulaire processen. </ P>
Introduction
Cryo-electron tomography (cryoET) is een krachtige imaging techniek die driedimensionale (3D) visualisatie van cellen en weefsels mogelijk maakt en geeft inzicht in de organisatie van de inheemse organellen en cellulaire structuren op moleculaire resolutie in een dicht-bij fysiologische toestand 1. Echter, de inherent lage contrast van ongekleurde bevroren gehydrateerde monster, gecombineerd met hun stralingsgevoeligheid, bemoeilijkt gebieden plaats binnen een cel lokaliseren en vervolgens uitvoeren van de tilt series succes zonder beschadiging van het doelgebied. Om deze problemen te overwinnen, een correlatieve benadering die licht en elektronenmicroscopie combineert noodzakelijk. Bijzonderheden gemarkeerd door fluorescentielabelling worden geïdentificeerd en gelokaliseerd door fluorescentie microscopie, en vervolgens de coördinaten worden overgedragen aan de elektronenmicroscoop voor het ingaan van hoge resolutie 3D structurele gegevens. Deze correlatieve methode helpt het lokaliseren van de doelgroep eenReas van belang zijn worden aangepakt. Door de beperking van monsterdikte met cryoEM (<300 nm), nog alleen de randgebieden van de cel geschikt voor 3D structuuranalyse door CryoET. Verdere vermindering van de dikte van bevroren gehydrateerd monsters door glasvocht snijden 8 of door cryo-focused ion beam (FIB) frezen 9 zou het vermogen van correlatieve beeldvorming breiden.
Voorheen werden correlatieve methoden voornamelijk gebruikt om cryoET data acquisitie voor grote en statische constructies 10-13 vergemakkelijken. In deze studies zijn cryo-fasen geïmplementeerd om cryoEM roosters accepteren en passen op ofwel een rechtopstaande microscoop of een omgekeerde microscoop 10,11,14. Hoewel schakelende grids lijkt vrij eenvoudig in hun ontwerpen, zijn er extra stappen die overdracht van de EM rooster, waardoor de kans dat het rooster kan worden vervormd, beschadigd en vervuild. We hebben onlangs aangetoond een technische vooruitgang incorrelatieve microscopie die ons in staat stelt om direct te visualiseren dynamische gebeurtenissen die van nature moeilijk te vangen, zoals HIV-1 en gastheercel interactie in een vroeg stadium van de infectie 15. We bereikte dit door het ontwerpen en implementeren van een cryo-lichtmicroscopie monstertafel dat een cartridge systeem om het monster schade door raster handling minimaliseren aanpast, waardoor het gemakkelijker correlatie. Ons ontwerp omvat een geïntegreerd exemplaar patroonhouder, waardoor beide cryo-licht en cryo-elektronenmicroscopie worden uitgevoerd, achtereenvolgens, op hetzelfde monster houder, zonder monster overdracht, waardoor het stroomlijnen van het correlatieve proces. Daarnaast hebben we eveneens uitgevoerd een nauwkeurige en betrouwbare correlatie procedure met fluorescerende latex kralen als markeerders.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een eenvoudige set protocollen gepresenteerd aan een geavanceerde correlatieve benadering te analyseren dynamische cellulaire gebeurtenissen met behulp van time-lapse confocale, levende cellen fluorescentie beeldvorming gevolgd door cryoET bieden. De methodologische ontwikkeling 3D levende cellen beeldvorming met hoge resolutie cryoET correleren is cruciaal voor vele uitdagende biologische problemen, zoals zeldzame visualiseren, dynamische (niet statisch, zoals eerder vermeld), en diffractie beperkte virale de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Travis Wheeler en de werkplaats aan de afdeling Celbiologie en Fysiologie, Universiteit van Pittsburgh bedanken voor de bouw van de cryo-fluorescentie monstertafel, Changlu Tao en Cheng Xu aan de Universiteit van Wetenschap en Technologie van China voor technische bijstand, en Dr Teresa Brosenitsch voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
