Microscopie corrélative pour l'analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Summary

Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d'accueil.

Abstract

Tomographie cryo-électronique (cryoET) permet la visualisation 3D des structures cellulaires à la résolution moléculaire dans un état ​​proche de l'physiologique ^1. Toutefois, la visualisation directe des complexes viraux individuels dans leur environnement cellulaire hôte avec cryoET est difficile ^2, en raison de la nature peu fréquente et dynamique de l'entrée virale, en particulier dans le cas de HIV-1. Tandis que l'imagerie des cellules vivantes time-lapse a donné beaucoup d'informations sur de nombreux aspects du cycle de vie du VIH-1 ^3-7, la résolution offerte par microscopie de cellules vivantes est limitée (~ 200 nm). Notre travail visait à développer une méthode de corrélation qui permet la visualisation directe des événements précoces de l'infection au VIH-1 en combinant microscopie fluorescente des cellules vivantes, la cryo-microscopie fluorescente, et cryoET. De cette manière, les signaux des cellules vivantes et cryo-fluorescent peuvent être utilisés pour guider avec précision l'échantillonnage en cryoET. En outre, des informations structurales obtenues cryoET peut be complétée avec les données fonctionnelles dynamiques acquises par imagerie des cellules vivantes de fluorescent cible marquée.

Dans cet article, vidéo, nous fournissons des méthodes et des protocoles détaillés de l'enquête structurelle du VIH-1 et interactions de la cellule hôte en utilisant l'imagerie des cellules vivantes 3D corrélative à grande vitesse et haute résolution cryoET analyse structurelle. Des cellules HeLa infectées avec des particules de VIH-1 ont été caractérisés d'abord par microscopie confocale de cellules vivantes, et la région contenant la même particule virale ont ensuite été analysées par tomographie cryo-électronique pour plus de détails structuraux 3D. La corrélation entre les deux ensembles de données d'imagerie, l'imagerie optique et l'imagerie électronique, a été réalisé en utilisant une étape de microscopie optique de fluorescence cryo-maison-bâti. L'approche décrite ici sera utile, non seulement pour l'étude des interactions virus-cellule hôte, mais aussi pour des applications plus larges de la biologie cellulaire, tels que la signalisation cellulaire, le trafic de récepteur membranaire, et de nombreux autres processus cellulaires dynamiques. </ P>

Introduction

Tomographie cryo-électronique (cryoET) est une puissante technique d'imagerie qui permet la visualisation en trois dimensions (3D) de cellules et de tissus et fournit un aperçu de l'organisation des organites indigènes et les structures cellulaires à la résolution moléculaire dans un proche de l'état physiologique ^1. Cependant, la nature, faible contraste de unstained spécimen congelé hydraté, combinée avec leur sensibilité aux rayonnements, il est difficile de localiser les zones d'intérêt à l'intérieur d'une cellule et effectuer ensuite la série inclinaison succès sans endommager la zone cible. Afin de surmonter ces problèmes, une approche corrélative qui combine la microscopie optique et électronique est nécessaire. Les caractéristiques spécifiques mis en évidence par un marquage fluorescent sont identifiés et localisés par microscopie optique à fluorescence, puis leurs coordonnées sont transférés à la microscopie électronique pour l'acquisition de la résolution des données structurelles élevées 3D. Cette méthode permet de localiser corrélative la cible d'unereas d'intérêt à traiter. En raison de la limitation de l'épaisseur de l'échantillon avec cryoEM (<300 nm), actuellement seules les régions périphériques de la cellule sont appropriés pour l'analyse structurale 3D par CryoET. Réduire encore l'épaisseur des échantillons congelés-hydratés par vitré coupe ⁸ ou par cryo-faisceau d'ions focalisé (FIB) fraisage ⁹ augmenterait la capacité de l'imagerie corrélative.

Auparavant, les méthodes corrélatives ont été principalement utilisés pour faciliter l'acquisition des données cryoET pour les grandes structures et statique ^10-13. Dans ces études, cryo-étapes ont été mises en place pour accepter les grilles de cryoEM et monter soit sur ​​un microscope droit ou d'un microscope inversé ^10,11,14. Bien que des grilles de commutation semble assez simple dans leurs conceptions, il existe d'autres étapes pour transférer la grille EM, qui augmente les chances que la grille peut être déformé, endommagé et contaminé. Nous avons récemment démontré un progrès technique dansmicroscopie corrélative qui nous permet de visualiser directement des événements dynamiques qui sont par nature difficiles à saisir, comme le VIH-1 et interactions de la cellule hôte à des stades précoces de l'infection ^15. Nous y sommes parvenus en concevant et réalisant une étape d'échantillonnage cryo-microscopie lumière qui adapte un système de cartouches pour minimiser les dégâts de l'échantillon due à la manipulation de la grille, facilitant ainsi la corrélation. Notre conception comprend un support de la cartouche d'échantillon intégré, permettant à la fois la cryo-microscopie lumineuse et cryo-électronique à effectuer, de manière séquentielle, sur le même porte-échantillon, sans transfert de l'échantillon, rationalisant ainsi le processus corrélatif. En outre, nous avons également mis en place une procédure d'établir une corrélation précise et fiable en utilisant des billes de latex fluorescentes comme marqueurs fiduciaires.

Protocol

1. HeLa culture cellulaire sur le carbone, plaquée or EM Finder Grids La décharge luminescente du côté de carbone d'un R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil or EM finder grille de moins de 25 mA pendant 25 sec. Manteau de la grille EM avec de la fibronectine, par celle-ci, du côté de carbone flottant vers le bas, sur une gouttelette 40 ul de 50 pg / solution de fibronectine ml, puis désinfecter sous lumière UV pendant 2 h dans une hotte de culture de tissus. Cellules plaque HeLa sur la…

Representative Results

Pour caractériser le comportement dynamique des particules virales, des cellules HeLa infectées par le VIH-1 ont été imagées par microscopie confocale de cellules vivantes à grande vitesse et les mouvements de particules ont été analysés par suivi de particules en 3D automatisé (Figure 1). Pour éviter le laps de temps de plusieurs minutes qui peuvent survenir entre la collecte de la dernière image confocale des cellules vivantes et plongez-gel (qui peut être assez long pour perdre corrélé…

Discussion

Nous avons présenté un ensemble simple de protocoles pour fournir une approche corrélative de pointe pour analyser les événements cellulaires dynamiques en utilisant time-lapse imagerie confocale de fluorescence, des cellules vivantes suivie par cryoET. Notre développement méthodologique de corréler imagerie des cellules vivantes 3D à haute résolution cryoET est essentiel d'étudier de nombreux problèmes biologiques complexes, telles que la visualisation rares dynamiques et diffraction des particules vira…

Materials

			Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
			Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.