Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen
Summary
Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.
Abstract
Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ermöglicht 3D-Visualisierung von zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem close-to-physiologischen Zustand 1. Allerdings ist die direkte Visualisierung einzelner viraler Komplexe in ihrem Wirt zellulären Umgebung mit cryoET herausfordernd 2, aufgrund der seltenen und dynamischen Charakter der das Eindringen des Virus, insbesondere im Fall von HIV-1. Während Zeitraffer-Live-Cell-Imaging eine große Menge an Informationen über viele Aspekte des Lebenszyklus von HIV-Januar 03-07 geführt hat, die Auflösung durch Live-Cell-Mikroskopie geleistet wird, ist begrenzt (~ 200 nm). Unsere Arbeit wurde bei der Entwicklung einer Methode, die Korrelation direkte Visualisierung der frühen Ereignisse des HIV-1-Infektion ermöglicht durch die Kombination von lebenden Zellen Fluoreszenzlichtmikroskopie, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und cryoET abzielen. Auf diese Weise kann in lebenden Zellen und Kryo-fluoreszierenden Signale zur genauen Führung der Probenahme in cryoET werden. Darüber hinaus strukturelle Informationen aus cryoET kann b erhaltene mit den dynamischen funktionellen Daten ergänzt gewonnen durch Live-Cell-Imaging von fluoreszierenden markierten Ziel.
In diesem Video-Artikel, bieten wir detaillierte Methoden und Protokolle zur strukturellen Untersuchung von HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen mit 3D Korrelat High-Speed Live-Cell-Imaging und hochauflösende cryoET Strukturanalyse. HeLa Zellen, die mit HIV-1-Partikeln infiziert wurden zuerst durch konfokale Mikroskopie lebenden Zellen dadurch, und die Region, die den gleichen viralen Partikel wurde dann durch Kryo-Elektronen-Tomographie zur 3D-Struktur-Details analysiert. Die Korrelation zwischen zwei Sätzen von Bilddaten, optische Bildgebung und Elektronenabbildungseinrichtung, wurde unter Verwendung eines selbst zusammengestellten Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie Stufe. Der Ansatz detailliert hier wertvoll sein wird, nicht nur für die Untersuchung von Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen, sondern auch für breitere Anwendungen in der Zellbiologie, wie z. B. Zell-Signal-, Membran-Rezeptor-, und viele andere dynamische zelluläre Prozesse. </ P>
Introduction
Cryo-Elektronen-Tomographie (cryoET) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das drei-dimensionale (3D) Visualisierung von Zellen und Geweben ermöglicht und Einblicke in die Organisation von nativen Organellen und zellulären Strukturen auf molekularer Auflösung in einem nahe-zu physiologischen Zustand 1. Allerdings macht die inhärent niedrigen Kontrast von ungefärbten tiefgefrorenen Probe mit ihrer Strahlung Empfindlichkeit kombiniert, ist es schwierig, Bereiche von Interesse in einer Zelle zu lokalisieren und anschließend die Durchführung der Kippserie erfolgreich ohne Beschädigung des Zielbereichs. Um diese Probleme zu überwinden, ist ein Ansatz, der korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie kombiniert notwendig. Spezifische Eigenschaften von Fluoreszenz-Markierung hervorgehoben werden identifiziert und lokalisiert durch Fluoreszenz Lichtmikroskopie und dann ihre Koordinaten auf dem Elektronenmikroskop für den Erwerb von hochauflösenden 3D-Strukturdaten übertragen. Diese Methode hilft Korrelat Ortung des Ziels einreas von Interesse angesprochen werden. Durch die Begrenzung auf Probe Dicke mit Kryo-EM (<300 nm), die derzeit nur die peripheren Regionen der Zelle sind geeignet für 3D-Strukturanalyse durch CryoET. Weitere Verringerung der Dicke der tiefgefrorenen Proben durch Glaskörper Schneiden 8 oder durch Kryo-Focused Ion Beam (FIB)-Fräsen 9 erweitern würde die Fähigkeit der korrelativen Bildgebung.
Bisher wurden korrelative Methoden in erster Linie verwendet, um cryoET Datenerfassung für große und statischen Strukturen 10-13 erleichtern. In diesen Studien wurden Kryo-Stufen realisiert, um Kryo-EM-Gittern zu akzeptieren und passen entweder auf einem aufrechten Mikroskop oder einem inversen Mikroskop 10,11,14. Obwohl Umschalten Gitter scheint recht einfach in ihre Konstruktionen gibt es weitere Schritte zur Übertragung des EM Netz beteiligt sind, die Chance zu erhöhen, dass das Gitter verformt werden, beschädigt und verunreinigt. Wir haben vor kurzem gezeigt, einen technischen Fortschritt inkorrelative Mikroskopie, die uns direkt sichtbar dynamische Ereignisse, die von Natur aus schwer zu erfassen, wie z. B. HIV-1-und Host-Zell-Interaktionen in frühen Stadien der Infektion 15 erlaubt. Wir erreichten dies durch die Entwicklung und Implementierung eines Kryo-Lichtmikroskopie Probe Bühne, die eine Cartridge-System, um die Probe Schäden durch Gitter Handhabung minimieren passt, und erleichtert so Korrelation. Unser Design verfügt über einen integrierten Probe Kartuschenhalters, so dass sowohl Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie durchgeführt, werden nacheinander auf der gleichen Probenhalter, ohne Probe zu übertragen, damit die Straffung des korrelativen Verfahren. Darüber hinaus haben wir auch eine genaue und zuverlässige Korrelation Verfahren unter Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen als Bezugsmarker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine einfache Reihe von Protokollen vorgelegt, um eine erweiterte korrelativen Ansatz zur dynamischen zellulären Ereignissen mit Zeitraffer-konfokale, Live-Zell-Fluoreszenz-Imaging von cryoET gefolgt analysieren zu stellen. Unsere methodische Entwicklung zur 3D-Live-Cell-Imaging mit hochauflösenden cryoET korrelieren ist entscheidend für viele anspruchsvolle biologische Probleme, wie die Visualisierung selten, dynamisch (nicht statisch, wie bereits berichtet) und beugungsbegrenzter viralen Partikel und ihre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Travis Wheeler und die Werkstatt am Institut für Zellbiologie und Physiologie, University of Pittsburgh für den Bau des Kryo-Fluoreszenzprobe Bühne Changlu Tao und Cheng Xu an der University of Science and Technology of China danken für die technische Unterstützung und Dr. Teresa Brosenitsch für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (GM082251 & GM085043) unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
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