गतिशील सहभागिता की 3 डी स्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए correlative माइक्रोस्कोपी
Summary
हम उच्च गति 3 डी रहने कक्ष फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोपी और उच्च संकल्प क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी को जोड़ती है एक correlative माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन है. हम इमेजिंग गतिशील, मेजबान HELA कोशिकाओं के साथ बातचीत के दौरान छोटे एचआईवी -1 कणों से correlative विधि की क्षमता प्रदर्शित करता है.
Abstract
क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (cryoET) एक बंद को शारीरिक स्थिति 1 में आणविक संकल्प पर सेलुलर संरचनाओं के 3 डी दृश्य की अनुमति देता है. हालांकि, cryoET साथ अपने मेजबान सेलुलर वातावरण में व्यक्ति वायरल परिसरों के प्रत्यक्ष दृश्य विशेष रूप से एचआईवी -1 के मामले में, वायरल प्रविष्टि के निराला और गतिशील प्रकृति के कारण, 2 चुनौती दे रहा है. समय चूक जीना सेल इमेजिंग एचआईवी 03-07 जनवरी के जीवन चक्र के कई पहलुओं के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्राप्त हुए है, वहीं संकल्प रहते सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा afforded (~ 200 एनएम) सीमित है. हमारा काम, रहने कक्ष फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संयोजन क्रायो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, और cryoET द्वारा एचआईवी -1 संक्रमण के प्रारंभिक घटनाओं के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट कि एक संबंध विधि को विकसित करने के उद्देश्य से किया गया था. इस तरीके में, रहने कक्ष और क्रायो फ्लोरोसेंट संकेतों सही cryoET में नमूने मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, संरचनात्मक जानकारी cryoET कर सकते हैं ख से प्राप्तगतिशील कार्यात्मक डेटा के साथ पूरक ई फ्लोरोसेंट लेबल लक्ष्य का जीना सेल इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त की.
इस वीडियो लेख में, हम संरचनात्मक एचआईवी -1 की जांच और 3 डी correlative उच्च गति जीना सेल इमेजिंग और उच्च संकल्प cryoET संरचनात्मक विश्लेषण का उपयोग मेजबान सेल बातचीत के लिए विस्तृत तरीके और प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. एचआईवी -1 कणों से संक्रमित HELA कोशिकाओं कोंफोकल रहने कक्ष माइक्रोस्कोपी द्वारा पहली विशेषता थे, और एक ही वायरल कण युक्त क्षेत्र तो 3 डी संरचनात्मक विवरण के लिए क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया गया था. इमेजिंग डेटा, ऑप्टिकल इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन इमेजिंग के दो सेट के बीच संबंध एक घर में निर्मित क्रायो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश मंच का प्रयोग कर प्राप्त किया गया था. यहाँ विस्तृत दृष्टिकोण वायरस मेजबान सेल बातचीत के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी इस तरह के सेल संकेतन, झिल्ली रिसेप्टर की तस्करी जैसे कोशिका जीव विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोगों,, और कई अन्य गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए ही नहीं, मूल्यवान होगा. </ P>
Introduction
क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (cryoET) कोशिकाओं और ऊतकों के तीन आयामी (3 डी) दृश्य की अनुमति देता है और एक बंद करने के लिए शारीरिक स्थिति 1 में आणविक प्रस्ताव पर देशी organelles और सेलुलर संरचनाओं के संगठन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक है. हालांकि, उनके विकिरण संवेदनशीलता के साथ संयुक्त बेदाग जमी हाइड्रेटेड नमूना, का स्वाभाविक कम विपरीत यह मुश्किल एक सेल के अंदर हित के क्षेत्रों का पता लगाने और बाद में लक्ष्य क्षेत्र को नुकसान पहुँचाए बिना सफलतापूर्वक झुकाव श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए आता है. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है एक correlative दृष्टिकोण आवश्यक है. फ्लोरोसेंट लेबलिंग से प्रकाश डाला विशिष्ट सुविधाओं की पहचान और प्रकाश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थित है, और फिर उनके निर्देशांक उच्च संकल्प 3 डी संरचनात्मक डेटा के अधिग्रहण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. इस correlative विधि एक लक्ष्य लगाने में मदद करता हैब्याज की reas संबोधित किया जाना है. CryoEM (<300 एनएम) के साथ नमूना मोटाई पर सीमा के कारण, वर्तमान में सेल के केवल परिधीय क्षेत्रों CryoET द्वारा 3 डी संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. इसके अलावा मिलिंग 9 शीशे 8 सेक्शनिंग द्वारा या क्रायो केंद्रित आयन बीम (मिथ्या) से जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों की मोटाई कम करने correlative इमेजिंग की क्षमता का विस्तार होगा.
इससे पहले, correlative के तरीकों में मुख्य रूप से बड़े और स्थिर संरचनाओं 10-13 के लिए cryoET डाटा अधिग्रहण की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया. इन अध्ययनों में, क्रायो चरणों cryoEM ग्रिड स्वीकार करते हैं और एक ईमानदार माइक्रोस्कोप या एक औंधा माइक्रोस्कोप 10,11,14 या तो पर फिट करने के लिए लागू किया गया है. ग्रिड स्विचिंग उनके डिजाइन में काफी सरल लगता है,, ईएम ग्रिड के लिए शामिल कदम स्थानांतरित ग्रिड, विकृत क्षतिग्रस्त और दूषित हो सकता है कि मौका बढ़ती अतिरिक्त रहे हैं. हमने हाल ही में एक तकनीकी अग्रिम का प्रदर्शनहमें सीधे संक्रमण 15 के प्रारंभिक दौर में इस तरह के एचआईवी -1 और मेजबान सेल बातचीत के रूप में कब्जा करने के लिए प्रकृति से मुश्किल हो जाता है कि गतिशील घटनाओं, कल्पना करने के लिए अनुमति देता है कि correlative माइक्रोस्कोपी. हम इस प्रकार के संबंध को सुविधाजनक बनाने, ग्रिड से निपटने के कारण नमूना क्षति को कम करने के लिए एक कारतूस प्रणाली adapts कि एक क्रायो प्रकाश माइक्रोस्कोपी नमूना मंच डिजाइन और लागू करने से यह पूरा. हमारे डिजाइन दोनों क्रायो प्रकाश और क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस प्रकार correlative प्रक्रिया को व्यवस्थित बनाने, नमूना हस्तांतरण के बिना, एक ही नमूना धारक पर, क्रमिक रूप से, प्रदर्शन करने की अनुमति, एक एकीकृत नमूना कारतूस धारक शामिल हैं. इसके अलावा, हम भी असंदिग्ध मार्कर के रूप में फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती का उपयोग कर एक सटीक और विश्वसनीय सहसंबंध प्रक्रिया लागू किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम cryoET द्वारा पीछा समय व्यतीत कोंफोकल, रहने कक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर गतिशील सेलुलर घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए एक उन्नत correlative दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए प्रोटोकॉल का एक सरल सेट प्रस्तु?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों तकनीकी के लिए क्रायो प्रतिदीप्ति नमूना मंच, चीन के विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय में Changlu ताओ और चेंग जू के निर्माण के लिए ट्रैविस व्हीलर और सेल बायोलॉजी विभाग में मशीन की दुकान और फिजियोलॉजी, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहूंगा सहायता, और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. टेरेसा Brosenitsch. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (GM082251 और GM085043) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
