Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas
Summary
Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.
Abstract
Cryo-tomografía electrónica (cryoET) permite la visualización 3D de las estructuras celulares con resolución molecular en un estado cercano al fisiológico 1. Sin embargo, la visualización directa de los complejos virales individuales en su ambiente celular del huésped con cryoET 2 es un reto, debido a la naturaleza poco frecuente y dinámica de la entrada viral, en particular en el caso de VIH-1. Mientras time-lapse de imágenes de células vivas ha dado una gran cantidad de información sobre muchos aspectos del ciclo de vida del VIH-1 3-7, la solución ofrecida por microscopia de células vivas es limitada (~ 200 nm). Nuestro trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un método de correlación que permite la visualización directa de los eventos tempranos de la infección por VIH-1 mediante la combinación de células vivas microscopía de luz fluorescente, la crio-microscopía fluorescente y cryoET. De esta manera, las señales de células en vivo y crio-fluorescente se pueden utilizar para guiar con precisión la toma de muestras en cryoET. Por otra parte, la información estructural obtenida de cryoET puede be complementado con los datos funcionales dinámicas adquirida a través de imágenes de células vivas de fluorescente diana marcada.
En este artículo de vídeo, ofrecemos métodos y protocolos detallados para la investigación estructural de VIH-1 y las interacciones de la célula huésped utilizando correlativa de imágenes de células vivas 3D de alta velocidad y alta resolución cryoET análisis estructural. Células HeLa infectadas con partículas de VIH-1 se caracterizan por primera vez por microscopía confocal de células vivas, y la región que contiene la misma partícula viral se analizaron a continuación por crio-tomografía de electrones para los detalles estructurales 3D. La correlación entre dos conjuntos de datos de imágenes, proyección de imagen óptica y electrónica de imágenes, se logró mediante una etapa microscopía óptica crio-fluorescencia de fabricación casera. El enfoque detallado aquí será de gran valor, no sólo para el estudio de las interacciones de células virus-huésped, sino también para aplicaciones más amplias en la biología celular, tales como señalización, tráfico de receptor de membrana celular, y muchos otros procesos celulares dinámicos. </ P>
Introduction
Cryo-tomografía de electrones (cryoET) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la visualización en tres dimensiones (3D) de las células y los tejidos y proporciona información detallada sobre la organización de los orgánulos nativas y estructuras celulares en resolución molecular en un primer estado fisiológico a 1. Sin embargo, la inherentemente bajo contraste de muestra congelada sin teñir-hidratado, combinada con su sensibilidad a la radiación, hace que sea difícil la localización de áreas de interés dentro de una célula y, posteriormente, la realización de la serie de inclinación con éxito sin dañar el área de destino. Con el fin de superar estos problemas, un enfoque correlativo que combina microscopía de luz y de electrones es necesario. Características específicas de relieve por marcaje fluorescente se identifican y se encuentran por microscopía de luz de fluorescencia, y a continuación, sus coordenadas se transfieren al microscopio electrónico para la adquisición de los datos estructurales 3D de alta resolución. Este método correlativo ayuda a localizar el objetivo de unreas de interés que deben abordarse. Debido a la limitación sobre el espesor de la muestra con cryoEM (<300 nm), actualmente sólo las regiones periféricas de la célula son adecuados para el análisis estructural 3D por CryoET. Una mayor reducción del espesor de las muestras congeladas, hidratadas por vítreo seccionar 8 o crio-centrado del haz de iones (FIB) de molienda 9 ampliaría la capacidad de proyección de imagen correlativa.
Anteriormente, los métodos correlativos se utilizaron principalmente para facilitar la adquisición de datos cryoET para las grandes y estática estructuras 10-13. En estos estudios, crio-etapas se han aplicado a aceptar rejillas cryoEM y cabe en cualquier un microscopio vertical o un microscopio invertido 10,11,14. Aunque las redes de conmutación parece bastante sencillo en sus diseños, hay adicional transferencia de pasos implicados para la red EM, el aumento de la probabilidad de que la red puede ser deformada, dañada y contaminada. Recientemente hemos demostrado un avance técnico enmicroscopía correlativa que nos permite visualizar directamente los eventos dinámicos que son por naturaleza difíciles de capturar, como el VIH-1 y las interacciones de células huésped en las primeras etapas de la infección 15. Esto lo logramos a través del diseño e implementación de una plataforma de muestra crio-microscopía de luz que se adapta un sistema de cartucho para minimizar el daño espécimen debido a la manipulación red, facilitando así la correlación. Nuestro diseño incluye un soporte del cartucho de muestra integrada, que permite tanto la crio-microscopía de luz y electrónica criogénica a realizar, de forma secuencial, en el mismo soporte de la muestra, sin transferencia de la muestra, lo que agiliza el proceso correlativo. Además, también implementado un procedimiento de correlación precisa y fiable el uso de perlas de látex fluorescentes como marcadores fiduciales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado un conjunto sencillo de protocolos para proporcionar un enfoque correlativo avanzada para analizar los procesos celulares dinámicos mediante time-lapse confocal de fluorescencia de células vivas seguido cryoET. Nuestro desarrollo metodológico para correlacionar imágenes de células vivas 3D con alta resolución cryoET es fundamental para investigar muchos problemas biológicos difíciles, tales como la visualización y partículas raras, dinámica (no estática, como se informó anteriormente) de di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Travis Wheeler y el taller de máquinas en el Departamento de Biología Celular y Fisiología de la Universidad de Pittsburgh para la construcción de la etapa de la muestra crio-fluorescencia, Changlu Tao Cheng y Xu de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China para la técnica asistencia, y el Dr. Teresa Brosenitsch para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM082251 GM085043 y).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
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