Korrelat mikroskopi för 3D Strukturell Analys av dynamisk samverkan
Summary
Vi beskriver ett korrelat mikroskopi metod som kombinerar hög hastighet 3D live-cell fluorescerande ljus mikroskopi och högupplösta Cryo-elektron tomografi. Vi visar förmågan hos korrelativa metod genom avbildning dynamisk, små HIV-1 partiklar interagerar med värd-HeLa-celler.
Abstract
Cryo-elektron tomografi (cryoET) möjliggör 3D-visualisering av cellulära strukturer på molekylär upplösning i en nära-till-fysiologiska tillstånd 1. Emellertid är direkt visualisering av individuella virala komplex i deras värd cellulära miljön med cryoET utmanande 2, på grund av den ovanliga och dynamiska karaktär viralt inträde, i synnerhet i fallet med HIV-1. Medan tidsförlopp live-cell imaging har gett en hel del information om många aspekter av livscykeln för HIV-1 3-7, den resolution som ges genom live-cell mikroskopi är begränsad (~ 200 nm). Vårt arbete syftar till att utveckla en korrelation metod som tillåter direkt visualisering av tidiga händelser av HIV-1-infektion genom att kombinera live-cell lysrör mikroskopi, kryo-fluorescerande mikroskopi, och cryoET. På detta sätt kan live-cell och Cryo-fluorescerande signaler användas för att exakt styra provtagningen i cryoET. Dessutom strukturell information från cryoET kan be kompletteras med dynamiska funktionella data som insamlas genom live-cell imaging av fluorescerande märkta mål.
I denna video artikeln ger vi detaljerade metoder och protokoll för strukturell undersökning av HIV-1 och host-cell interaktioner med 3D correlative höghastighetståg live-cell imaging och högupplösta cryoET strukturanalys. HeLa-celler infekterade med HIV-1-partiklar karaktäriserades först genom konfokal live-cell mikroskopi, och den region som innehåller samma viruspartikeln analyserades sedan med Cryo-elektron tomografi för 3D strukturella detaljer. Korrelationen mellan två uppsättningar av bilddata, optisk avbildning och elektron avbildning, uppnåddes med hjälp av en hembyggda Cryo-fluorescens skede ljusmikroskop. Den metod som beskrivs här kommer att vara värdefull, inte bara för studier av virus-värd cellinteraktioner, men även för bredare tillämpningar inom cellbiologi, såsom cell signalering, membranreceptor människohandel, och många andra dynamiska cellulära processer. </ P>
Introduction
Cryo-elektron tomografi (cryoET) är en kraftfull bildteknik som gör tredimensionell (3D) visualisering av celler och vävnader och ger insikt i organisationen av infödda organeller och cellulära strukturer på molekylär upplösning i en nära-till fysiologiska tillstånd 1. Emellertid gör den inneboende låg kontrast av ofärgade fryst-hydratiserade prov i kombination med deras strålningskänslighet det svårt att lokalisera områden av intresse inuti en cell och därefter utföra lutningen serien framgångsrikt utan att skada målområdet. För att övervinna dessa problem, är en motsvarande metod som kombinerar ljus-och elektronmikroskopi nödvändigt. Specifika funktioner markerade med fluorescerande märkning identifieras och lokaliseras genom fluorescens ljusmikroskop, och sedan deras koordinater överförs till elektronmikroskop för förvärv av högupplösta 3D strukturella uppgifter. Denna korrelat metod hjälper lokalisera målet enReas av intresse åtgärdas. På grund av begränsningen av provets tjocklek med cryoEM (<300 nm), för närvarande endast de perifera regionerna i cellen är lämpliga för 3D strukturanalys genom CryoET. Ytterligare minska tjockleken av fryst-hydratiserade exemplar av glaskroppen sektionering 8 eller av Cryo fokuserad-ion beam (FIB) fräsning 9 skulle utöka kapaciteten av korrelat avbildning.
Tidigare var korrelat metoder används främst för att underlätta cryoET datainsamling för stora och statiska strukturer 10-13. I dessa studier har Cryo-steg vidtagits för att acceptera cryoEM nät och passar på antingen en upprätt mikroskop eller ett inverterat mikroskop 10,11,14. Även byta galler verkar ganska enkelt i sin design, det finns ytterligare överföring av stegen för EM nätet, ökar chansen att gallret kan deformeras, skadade och förorenade. Vi visade nyligen ett tekniskt framstegkorrelat mikroskopi som tillåter oss att direkt visualisera dynamiska händelser som är av naturen svåra att fånga, såsom HIV-1 och värd interaktioner cell vid tidiga stadier av infektion 15. Vi åstadkom detta genom att utforma och genomföra en Cryo-ljus scenen mikroskopi prov som anpassar en patron system för att minimera provet skador på grund av raster hantering, vilket underlättar korrelation. Vår design inkluderar en integrerad hållare exemplar patron, vilket både kryo-ljus och Cryo-elektronmikroskopi som ska utföras, sekventiellt, på samma preparathållare, utan provöverföring därmed effektivisera korrelat processen. Dessutom genomförde vi också en korrekt och tillförlitlig korrelation förfarande med fluorescerande latexpärlor som referenspunkternas markörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presenterat en enkel uppsättning protokoll för att ge en avancerad korrelat metod för att analysera dynamiska cellulära händelser med tidsförlopp konfokala, live-cell fluorescens avbildning följt av cryoET. Vår metodutveckling för att korrelera 3D live-cell imaging med hög upplösning cryoET är avgörande för att undersöka många utmanande biologiska problem, såsom visualisera sällsynta, dynamiska (inte statisk, som tidigare rapporterats), och diffraktionsbegränsade viruspartiklar och deras intera…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Travis Wheeler och verkstaden vid institutionen för cellbiologi och fysiologi, University of Pittsburgh för byggandet av Cryo-fluorescens prov skede Changlu Tao och Cheng Xu vid University of Science and Technology i Kina för teknisk bistånd, och Dr Teresa Brosenitsch för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
