Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells
Summary
Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.
Abstract
Die nonobese diabetischen (NOD) Maus spontan entwickelt Autoimmun-Diabetes nach 12 Wochen alt und ist der am intensivsten untersuchten Tiermodell der menschlichen Typ-1-Diabetes (T1D). Zelltransfer Studien in bestrahlte Mäuse Empfänger haben festgestellt, dass T-Zellen sind entscheidende in T1D Pathogenese in diesem Modell. Wir beschreiben hier ein einfaches Verfahren, um schnell durch adoptiven Transfer von gereinigtem T1D induzieren primäre CD4 + T-Zellen von Pre-diabetischen NOD-Mäusen transgen für die Insel-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) BDC2.5 in NOD.SCID Empfängermäuse. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik sind, dass Isolation und adoptiven Transfer von T-Zellen diabetogene abgeschlossen werden kann innerhalb des gleichen Tages, Bestrahlung der Empfänger nicht erforderlich ist, und eine hohe Inzidenz von T1D ist innerhalb von 2 Wochen nach entlockte T-Zell-Transfer werden. So können Untersuchungen der Pathogenese und therapeutische Interventionen in T1D mit einer schnelleren Rate als bei Methoden, die auf heterogenen T-Zell-Populationen oder Klonen verlassen gehenabgeleitet von diabetischen NOD-Mäusen.
Introduction
Die NOD-Maus entwickelt Autoimmundiabetes spontan und wurde vielfach als Tiermodell für die menschliche T1D 1,2 verwendet. Pathogenese der T1D in NOD-Mäusen durch Infiltration, beginnend bei 3-4 Wochen alt, der pankreatischen Langerhans-Inseln von dendritischen Zellen und Makrophagen durch T und B-Zellen folgte. Diese Phase der zerstörungsfreien peri-Insulitis führt zu einem langsamen, fortschreitenden Zerstörung der Insulin-produzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, was zu manifester Diabetes von 4-6 Monaten 3 Jahren. Übertragen von Splenozyten 4,5, CD4 + oder CD8 + 6,7 8,9 T-Zellen von diabetischen NOD-Mäusen haben gezeigt, dass Diabetes bei immungeschwächten Mäusen NOD vermitteln, was anzeigt, dass Insel-reaktiven T-Zellen eine zentrale Rolle in T1D Pathogenese spielen. Abhängig von den experimentellen Bedingungen, entwickelt Diabetes in Empfängermäuse langsam, über mehrere Wochen in diesen Studien. Ebenso verschiedenen T-Zell-Klone, von Zeit-und kostenintensive abgeleitetKultivieren von diabetogenen T-Zellen wurde berichtet, Diabetes mehrere Wochen nach der Überführung in Empfängermäuse 7,10 vermitteln. Mit der Verfügbarkeit von transgenen Mäusen, die TCRs von CD4-oder CD8-restringierte T-Zell-Klone diabetogen, mehreren Laboratorien abgeleitet wurden später gezeigt, dass Milz-T-Zellen aus diesen Mäusen in der Lage, Diabetes Empfänger 11-13 übertragen wurden. Insbesondere sind BDC2.5 NOD-Mäuse transgen für das BDC2.5 TCR, die spezifisch für Chromogranin A, ein Protein in pankreatischen beta-Zellen 14-16 ist. Übertragen von in vitro-aktivierten oder un-aktivierte ganz oder fraktionierte Milzzellen offen Diabetiker oder prediabetic BDC2.5 Mäuse übertragen Diabetes bei Neugeborenen oder immungeschwächten NOD-Mäuse in unterschiedlichen Wirkungsgrade 11,17-19.
Wir beschreiben eine einfache Methode, die gereinigt transgenen CD4 + T-Zellen nutzt von Pre-diabetischen Mäusen BDC2.5 in Empfängermäuse bei hohem Wirkungsgrad und consiste T1D induzierenncy. Eine große Anzahl von naiven Insel Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus diesen Mäusen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für CD4 + CD62L + T Zellen, die das transgene TCR Vβ4 Kette isoliert. Gereinigtes transgenen T-Zellen werden dann ohne Aktivierung in NOD.SCID Mäusen, die Funktions-T-und B-Zellen fehlt und Insulitis-und Diabetes-freie 20 übertragen. Die Empfänger-Mäuse werden für erhöhte Konzentrationen von Urin Glucose T1D anzeigt, die sich schnell entwickelt sich innerhalb von zwei Wochen nach der T-Zell-Transfer überwacht.
Im Gegensatz zu anderen Methoden, die übertragen diabetogene T-Zellen mit heterogenen Besonderheiten, unser Protokoll FACS-sortierten CD4 + T-Zellen, die fast ausschließlich Ausdruck der diabetogene BDC2.5 TCR verwendet. Aufgrund ihrer Homogenität, sind nur eine kleine Anzahl von T-Zellen übertragen (~ 1×10 6 Zellen / Maus) für die schnelle Entwicklung T1D innerhalb von 2 Wochen bei 100% Inzidenz erforderlich. Ein weiterer Vorteil ist, dass unser Protokoll irradiation des Empfängers Mäusen ist nicht notwendig, da es für einige andere Methoden. Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist, dass es nicht zulassen, die Untersuchung der Beteiligung von CD4 und CD8 T-Zell-Untergruppen oder insbesondere CD8-T-Zellen bei Diabetes.
Die beschriebene Protokoll wird nützlich für die Untersuchung schneller T1D Entwicklung von naiven monospezifischen CD4 + T-Zellen, sowie therapeutische Strategien vermittelt, um in Homing von Inselzellen-Antigen-spezifische Th-Zellen in das Zielorgan eingreifen.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D in Empfängermäuse bei unterschiedlichen Wirkungsgrade durch adoptiven Transfer von ganzen Milzzellen oder T-Zell-Untergruppen von diabetischen NOD-Mäusen oder Mäusen transgenen TCR von diabetogene T-Zell-Klone abgeleitet induziert werden. Wir berichten hier über ein reproduzierbares Verfahren zur Induktion in Empfängermäuse innerhalb von zwei Wochen T1D bei 100% Inzidenz durch Übertragung FACS-gereinigten CD62L + BDC2.5 transgenen CD4 + T-Zellen in Mäusen NOD.SCID.
Besondere Vor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs.. Robert Bonneau und Neil Christensen für hilfreiche Kommentare.
Diese Arbeit wurde von der Pennsylvania State University College of Medicine Fonds unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
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