Applicazione di un<em> In vitro</em> DNA Protection Assay per visualizzare stress Mediazione Proprietà del Dps Protein
Summary
La proteina di legame al DNA dalle cellule affamate (DPS) gioca un ruolo cruciale nella lotta contro lo stress batterica. Questo articolo discute la purificazione<em> E. coli</em> PS e il protocollo per un<em> In vitro</em> Test dimostrando protezione Dps-mediata di DNA dalla degradazione dalle specie reattive dell'ossigeno.
Abstract
Lo stress ossidativo è un sottoprodotto inevitabile della vita aerobica. L'ossigeno molecolare è essenziale per il metabolismo terrestre, ma partecipa anche a molte reazioni dannose all'interno di organismi viventi. La combinazione di metabolismo aerobico e di ferro, che è un altro composto essenziale per la vita, è sufficiente a produrre radicali attraverso la chimica di Fenton e degradare componenti cellulari. Degradazione del DNA è probabilmente il processo più dannosa che coinvolgono radicali intracellulari, come la riparazione del DNA è tutt'altro che banale. Il saggio presentato in questo articolo offre una tecnica quantitativa per misurare e visualizzare l'effetto delle molecole ed enzimi sui danni al DNA radicale-mediata.
Il saggio di protezione del DNA è un semplice, rapido, e robusto strumento per la caratterizzazione in vitro delle proprietà protettive delle proteine o prodotti chimici. Esso consiste nell'esporre DNA ad una reazione ossidativa dannosa e aggiungendo concentrazioni varianti del composto di interesse. La riduzione o l'aumento di danno al DNA in funzione della concentrazione del composto è quindi visualizzato mediante elettroforesi su gel. In questo articolo si dimostra la tecnica del saggio di protezione del DNA misurando le proprietà protettive della proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). DPS è un mini-ferritina che è utilizzato da più di 300 specie di batteri per combattere con forza di stress ambientale. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione Dps e le condizioni di analisi ottimizzate per valutare la protezione del DNA dal Dps.
Introduction
Organismi aerobici devono lottare costantemente con le specie reattive dell'ossigeno che possono danneggiare il DNA e altre macromolecole biologiche cruciali. Uno strumento potente per contrastare gli effetti tossici del danno ossidativo è la proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). Fin dalla sua scoperta nel 1992 da fame E. coli cultura 1, Div. è stata identificata in più di 300 specie di batteri e archeobatteri 2. Upregulation massiccia di Dps durante la fase stazionaria lo rende il più altamente espresso proteina nucleoide-associato di E. coli in condizioni di fame 3, 4. Inoltre, Dps ha mostrato di preservare sia la vitalità batterica e l'integrità del DNA durante molte diverse sollecitazioni, tra cui la fame, ad alta concentrazione di ferro, l'esposizione alla luce UV, shock termico, e lo stress ossidativo 5, 6.
Strutturalmente, Dps auto-soci in un complesso stabile omo-oligomeri di 12 monomeri, which assemblare in un guscio vuoto sferico. Il ~ 4.5 nm-wide cavità interna è accessibile al solvente esterno attraverso pori che permettono il passaggio di piccole molecole 7, e può sequestrare metalli come ferro mineralizzati 8. L'effetto protettivo del Dps deriva dalle sue molteplici attività biochimiche, che comprendono non specifico DNA binding 1, l'attività ferrossidasica e deposito di ferro 8.
Studio dettagliato delle benefiche attività biochimiche del Dps richiede prima la sua purificazione. DPS purificazione è una procedura complessa, come PS devono essere separati non solo da altre proteine, ma anche da qualsiasi DNA legato 7. Nostro processo di purificazione ottimizzato utilizza molte tecniche comuni, costituito da due colonne di scambio ionico e di un passo precipitazione di solfato di ammonio. Sono necessari molti scambi di buffer, come Dps alta concentrazione possono precipitare dalla soluzione in condizioni di basso contenuto di sale. Una volta Dps proteina è stata purificata, Esso può essere applicato a saggi che misurano direttamente la sua attività ferrossidasica 8, stechiometria DNA-binding 9, e meccanismi di ferro vincolante 10. Dps purificate ha anche altre applicazioni potenziali. La struttura sferica cava stabile di DPS è stato utilizzato come impalcatura per la memorizzazione di particelle idrofobe all'interno della cavità proteina 11 e anche come camera di reazione per sintetizzare nuove nanoparticelle magnetiche 12.
La capacità protettiva del Dps di mediare i danni derivanti da specie reattive dell'ossigeno può essere chiaramente e direttamente dimostrato utilizzando il saggio di protezione del DNA 13, 14. In questa procedura in vitro, specie radicali sono prodotti quando ferro catalizza H 2 O 2 degradazione attraverso la chimica Fenton. Questi radicali danneggiare direttamente DNA presente nella reazione e possono degradare completamente a concentrazioni elevate. Due principali attività DPS può sia contrastare direttamente gli effetti di Fentproduzione di radicali on-mediata. Dps abbassa la concentrazione di ferro catalitico mediante mineralizzazione, consumando il perossido di idrogeno disponibile nel processo. Inoltre, Dps legame al DNA possono potenzialmente proteggerlo fisicamente dai danni dei radicali e lo condensa in un volume più piccolo con superficie meno reattivo. La combinazione di queste due proprietà rende il saggio di protezione DNA adatto per lo scopo di misurare l'attività protettiva Div..
Il saggio di protezione Il DNA è molto versatile e può essere utilizzato per una varietà di applicazioni oltre caratterizzazione Div.. I danni dei radicali è una comune forma di stress nelle cellule, e molte proteine e sostanze chimiche diverse sono utilizzati per contrastarla. Il principio generale del saggio, l'integrità del DNA utilizzando come marker per danni radicale, può essere utilizzato in combinazione con qualsiasi reazione producono radicali o un agente di contrasto. Tra gli altri, il saggio è stato usato con successo per determinare le proprietà anti-ossidantidi K. Estratto paniculata per l'industria alimentare 15, per caratterizzare gli effetti di acido urico a danno idrossile mediazione 16, e di acquisire nuove informazioni sulla funzione delle proteine Fur regolatore trascrizionale 17.
Nonostante i numerosi usi del saggio in articoli pubblicati, abbiamo scoperto che molti di ottimizzazione e risoluzione dei problemi sono stati richiesti, il che rende l'impostazione del test per la prima volta un processo inutilmente faticoso per molti ricercatori. Il protocollo che presentiamo in questo articolo si propone di rimuovere questa barriera per l'ingresso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il processo di purificazione Div. come descritto in questo articolo è molto robusto. La purezza è stata assai alta (> 99%); altre proteine appaiono su SDS-PAGE gel come bande visibili. Nonostante questo, alcuni lotti di Dps purificati sembrano avere attività nucleasi, come dimostra la degradazione del DNA parziale quando incubate con concentrazioni molto elevate di Dps. Ciò potrebbe indicare la presenza di DNasi altamente attivi a bassa concentrazione che non siamo riusciti a rimuovere attraverso la purific…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, e Kourosh Honarmand Ebrahimi per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti di avviamento dalla Delft University of Technology.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
| HEPES | BDH | 441476L |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
| Sodium chloride | VWR | 443824T |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
| MOPS | Calbiochem | 475898 |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
| Equipment | Company | Model |
| Static incubator | Hettich | INE500 |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
| Syringe needles | BD | 305128 |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
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