La proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS) desempeña un papel crucial en la lucha contra el estrés bacteriano. Este artículo aborda la purificación de<em> E. coli</em> AD y el protocolo para un<em> In vitro</em> Ensayo que demuestra la protección AD-mediada de ADN de la degradación por las especies reactivas de oxígeno.
El estrés oxidativo es un subproducto inevitable de la vida aeróbica. El oxígeno molecular es esencial para el metabolismo terrestre, sino que también participa en muchas reacciones perjudiciales dentro de organismos vivos. La combinación de metabolismo aeróbico y el hierro, que es otro compuesto vital para la vida, es suficiente para producir radicales a través de la química de Fenton y degradar los componentes celulares. La degradación del ADN es sin duda el proceso más dañino que implica radicales intracelulares, como la reparación del ADN está lejos de ser trivial. El ensayo presentado en este artículo ofrece una técnica cuantitativa para medir y visualizar el efecto de las moléculas y enzimas en el daño del ADN mediada por radicales.
El ensayo de protección de ADN es una herramienta sencilla, rápida y robusta para la caracterización in vitro de las propiedades protectoras de las proteínas o productos químicos. Se supone la exposición de ADN a una reacción oxidativa perjudicial y la adición de concentraciones variables del compuesto de interés. La reducción o el aumento de daño en el ADN como una función de la concentración de compuesto a continuación, se visualizaron mediante electroforesis en gel. En este artículo se demuestra la técnica del ensayo de protección de ADN mediante la medición de las propiedades protectoras de la proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS). DPS es un mini-ferritina que es utilizado por más de 300 especies de bacterias para combatir poderosamente estresores ambientales. Aquí presentamos el protocolo de purificación AD y las condiciones de ensayo optimizados para evaluar la protección del ADN por AD.
Los organismos aeróbicos deben enfrentarse constantemente con especies reactivas de oxígeno que pueden dañar su ADN, así como otras macromoléculas biológicas cruciales. Una herramienta potente para contrarrestar los efectos tóxicos de daño oxidativo es la proteína de unión al ADN de las células de hambre (DPS). Desde su descubrimiento en 1992 del hambre E. coli cultura 1, AD se ha identificado en más de 300 especies de bacterias y arqueobacterias 2. Regulación al alza masiva de AD durante la fase estacionaria la convierte en la más alta expresión de proteínas nucleoid asociada de E. coli bajo condiciones de hambre 3, 4. Además, DPS ha sido demostrado para preservar tanto la viabilidad bacteriana y la integridad del ADN durante muchas diversas tensiones, entre ellos el hambre, alta concentración de hierro, exposición a la luz UV, choque térmico, y el estrés oxidativo 5, 6.
Estructuralmente, DPS libre asociados a un complejo homo-oligómero estable de 12 monómeros, which montar en una cáscara hueco esférico. El ~ 4,5 nm en toda la cavidad interna es accesible para el disolvente a través de poros que permiten el paso de pequeñas moléculas de 7 exterior, y que es capaz de secuestrar metales mineralizados tales como hierro 8. El efecto protector de la AD se deriva de sus varias actividades bioquímicas, que incluyen ADN no específico de unión 1, la actividad ferroxidasa, y almacenamiento de hierro 8.
Estudio detallado de las actividades bioquímicas beneficiosos de AD requiere primero su purificación. AD purificación es un procedimiento elaborado, como AD deben estar separados no sólo a partir de otras proteínas, sino también de cualquier ADN unido 7. Nuestro proceso de purificación optimizado utiliza muchas técnicas comunes, que consiste en dos columnas de intercambio iónico y un paso de precipitación con sulfato de amonio. Se necesitan varios cambios de tampón, como AD altamente concentrados pueden precipitar fuera de la solución en condiciones de poca sal. Una vez que la proteína AD ha sido purificada, Que puede aplicarse a ensayos que miden directamente su actividad ferroxidasa 8, la estequiometría de unión a ADN 9, y los mecanismos de fijación de hierro 10. Dps purificada también tiene otras aplicaciones potenciales. La estructura esférica hueca estable de AD se ha utilizado como andamio para el almacenamiento de partículas hidrófobas dentro de la cavidad proteína 11 e incluso como una cámara de reacción para sintetizar nuevas nanopartículas magnéticas 12.
La capacidad protectora de AD para mediar los daños debidos a las especies reactivas de oxígeno puede ser clara y demostrada directamente mediante el ensayo de protección de DNA 13, 14. En este procedimiento in vitro, especies de radicales se producen cuando el hierro cataliza H 2 O 2 a través de la degradación química de Fenton. Estos radicales dañan directamente el ADN presente en la reacción y pueden degradar completamente a altas concentraciones. Dos actividades principales Dps pueden tanto contrarrestar directamente los efectos de Fenten la producción de radicales mediada. AD reduce la concentración de hierro catalítico a través de la mineralización, consumiendo el peróxido de hidrógeno disponible en el proceso. Además, AD unión al ADN potencialmente pueden protegerlo físicamente del daño de los radicales y lo condensa en un volumen más pequeño, con menos superficie reactiva. La combinación de estas dos propiedades hace que el ensayo de protección de ADN muy adecuado para el propósito de medir la actividad protectora AD.
El ensayo de protección de ADN es muy versátil y se puede utilizar para una variedad de aplicaciones más allá de AD caracterización. Daño de los radicales es una forma común de estrés en las células, y muchas proteínas y productos químicos diferentes se utilizan para contrarrestarlo. El principio general del ensayo, el uso de la integridad del ADN como un marcador para el daño de los radicales, se puede utilizar en combinación con casi cualquier reacción de radicales-productora o agente de contrarresto. Entre otros, el ensayo ha sido utilizado con éxito para determinar las propiedades anti-oxidantesde K. Extracto paniculata para su uso en la industria alimentaria 15, para caracterizar los efectos del ácido úrico en el daño hidroxilo mediación 16, y para obtener nuevos conocimientos sobre la función de la piel de la transcripción proteínas reguladoras 17.
A pesar de los numerosos usos del ensayo en los trabajos publicados, se encontró que eran necesarios muchos optimización y solución de problemas, lo que hace que la configuración del ensayo por primera vez un proceso innecesariamente laborioso para muchos investigadores. El protocolo que presentamos en este artículo tiene como objetivo eliminar esta barrera para la entrada.
El proceso de purificación de la AD que se describe en este artículo es muy robusto. Pureza ha sido consistentemente alto (> 99%), sin otras proteínas aparecen en geles de SDS-PAGE como bandas visibles. A pesar de esto, algunos lotes de AD purificadas parecen tener una actividad nucleasa, como se evidencia por la degradación parcial de ADN cuando se incubó con concentraciones muy altas de AD. Esto podría indicar la presencia de DNases gran actividad a bajas concentraciones que no fuimos capaces de eliminar a tr…
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen y Kourosh Honarmand Ebrahimi útil para los debates. Esta labor fue apoyada con una financiación inicial de la Universidad Tecnológica de Delft.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
HEPES | BDH | 441476L |
Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
Sodium chloride | VWR | 443824T |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
MOPS | Calbiochem | 475898 |
SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
Equipment | Company | Model |
Static incubator | Hettich | INE500 |
Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
Syringe needles | BD | 305128 |
Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |