Bestemmelse af Mikrobiel Extracellular enzymaktivitet i Vand, Jord og sediment ved hjælp af High Throughput Mikropladekrav Analyser

Summary

Mikroplade baserede procedurer er beskrevet for det kolorimetriske eller fluorometriske analyse af ekstracellulært enzymaktivitet. Disse procedurer giver mulighed for hurtig analyse af en sådan aktivitet i stort antal miljøprøver inden for et overskueligt tidsrum.

Abstract

Meget af næringsstofomsætning og kulstof forarbejdning i naturlige miljøer det sker gennem aktiviteten af ​​ekstracellulære enzymer frigivet af mikroorganismer. Således kan måling af aktiviteten af ​​disse ekstracellulære enzymer giver indsigt i satserne for økosystemet niveau processer, såsom organisk stof nedbrydning eller kvælstof og fosfor mineralisering. Analyser af ekstracellulær enzymaktivitet i miljøprøver involverer typisk udsætte prøverne kunstige kolorimetriske eller fluorometriske substrater og sporing hastigheden af ​​substrat hydrolyse. Her beskriver vi mikroplatte baserede metoder for disse procedurer, der tillader analyse af et stort antal prøver inden for en kort tidsramme. Prøverne får lov til at reagere med kunstige substrater i mikroplader med 96 brønde eller dyb brønd mikroplade blokke, og enzymaktiviteten efterfølgende bestemt ved absorption eller fluorescens af det resulterende slutprodukt anvendelse af en typisk mikroplade reader eller fluorometer. Sådanne high throughput procedurer ikke blot lette sammenligninger mellem rumligt forskellige steder eller økosystemer, men også i væsentlig grad reducere omkostningerne ved sådanne analyser ved at mindske de samlede reagens nødvendige per prøve mængder.

Introduction

Mikroorganismer, såsom bakterier og svampe finde næringsstoffer og kulstof fra komplekse organiske forbindelser gennem produktion af ekstracellulære enzymer. Disse enzymer typisk hydrolysere polymerer i mindre underenheder, der kan tages i cellen. Derfor, ved et økologisk niveau disse mikrobielle ekstracellulære enzymer er ansvarlig for meget af næringsstof mineralisering og nedbrydning af organisk materiale, der forekommer i naturlige miljøer. Enzymer, såsom cellobiohydrolase (CBH), og β-glucosidase er vigtige for cellulose nedbrydning og arbejde i fællesskab at katalysere hydrolyse af cellulose til glucose ^1,2, der tilvejebringer en anvendelige carbonsubstrat til mikrobiel optagelse og assimilation. Enzymet fosfatase frigiver opløselige uorganiske fosfat grupper fra organofosfater, hovedsagelig mineraliserende fosfat og gøre den tilgængelig til brug for de fleste organismer ^3. Andre enzymer, såsom N-acetylglucosaminidase (NAGase) er important i kitin nedbrydning og kan gøre både kulstof og kvælstof til rådighed for mikrobiel erhvervelse ^4..

En af de nærmere vilkår for analysen af mikrobiel ekstracellulær enzymaktivitet i naturlige miljøer er brugen af kunstige p-nitrophenyl (p NP) forbundne substrater, en tilgang, der oprindeligt blev udviklet til at detektere jord fosfataseaktivitet ^5.. Denne tilgang er baseret på påvisning af et farvet slutprodukt, p-nitrophenol, som frigives, når den kunstige substrat hydrolyseres af det relevante enzym. P-nitrophenol kan efterfølgende kvantificeres kolorimetrisk ved at måle dets absorbans på omkring 400-410 nm. Denne metode er siden blevet anvendt til påvisning af andre enzymer, såsom NAGase ^6, og har været anvendt i forskellige undersøgelser ser på mikrobiel ekstracellulære enzymaktivitet i jord og sedimenter ^7-9.

En alternativ fremgangsmåde, der var originally udviklet til at vurdere ekstracellulær glucosidaseaktivitet i vandmiljøer ^10,11 gør brug af 4-methylumbelliferon (MUB) i tilknytning substrater. Slutproduktet frigivet (4-methylumbelliferon) er meget fluorescerende og kan påvises ved hjælp af et fluorometer med en excitation / emission indstillingen omkring 360/460 nm. En række MUB forbundne kunstige substrater er til rådighed, tillader fluorometrisk måling af aktiviteten af mindst lige så mange enzymer (fx β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase), som kan analyseres ved hjælp af p NP-substrat kolorimetrisk procedure. Andre mikrobielle ekstracellulære enzymer, såsom protein-nedbrydende leucinaminopeptidase, kan analyseres fluorometrisk under anvendelse af 7-amino-4-methylcoumarin (COU) i tilknytning substrater. Både MUB-og DA-forbundne substrater er blevet anvendt til at bestemme enzymaktivitet i forskellige terrestriske og akvatiske prøver ^12,13.

Mens tidligere undersøgelser har descrIbed fluorometriske eller kolorimetrisk mikroplade tilgange til at bestemme ekstracellulær enzymaktivitet ^14, og der er behov for en klar præsentation af, hvordan til at gennemføre sådanne analyser. Her vi demonstrere procedurer for højt gennemløb mikroplade teknikker til analyse af ekstracellulære enzymaktivitet i jord og sedimenter ved hjælp af kolorimetrisk p NP-bundne substrater tilgang og i naturlige farvande ved hjælp af fluorescerende MUB-bundne substrater teknik. Vi fokuserer på måling af aktiviteterne i β-glucosidase, NAGase, og phosphatase som disse enzymer kan bindes til carbon, nitrogen og fosfor cykling, hhv. Imidlertid kan de her beskrevne procedurer kan anvendes til måling af andre ekstracellulære enzymer ved hjælp af forskellige kunstige substrater.

Protocol

Kolorimetrisk analyse af Extracellular enzymaktivitet i Jordbund og sediment 1.. Forberedelse af underlaget og Buffer Løsninger til Farvemåletekniske Analyser af enzymaktivitet Forbered 50 mM acetatpuffer (pH 5,0-5,5) ved at blande 50 ml 0,1 M eddikesyre (2,87 ml iseddike i 500 ml vand), 150 ml 0,1 M natriumacetat og 200 ml destilleret H2O PH justeres til 5,0-5,5 med 0,1 M eddikesyre, hvis nødvendigt. Der fremstilles en opløsning af 1 M natriumhydroxid (NaOH)…

Representative Results

Jord og akvatiske sedimenter typisk have mærkbare niveauer af ekstracellulær enzym aktivitet som følge af vedhæftede mikrobielle samfund (biofilm) vokser på overfladen af partikler. Figur 3 viser, hvordan denne aktivitet skifter afhængigt af størrelsen af partikler opnået fra overfladesedimentet en tredje For strøm i det nordlige Mississippi, USA. En tidligere undersøgelse har vist, at de bakterielle samfund på partikler sediment fra denne strøm kan opdeles i tre forskellige grupper baseret …

Discussion

Bestemmelse af aktiviteten af en række mikrobielle ekstracellulære enzymer i jord og sedimenter kan give nyttig indsigt i satserne for næringsstof mineralisering og organisk stof behandling ^17. Men jordbunden kan variere i deres fugtniveau, så det er vigtigt at standardisere aktivitet i jorden tørvægt. Dette kræver et ekstra tørring trin (typisk af to dage) end blot at måle enzymaktivitet. Således i modsætning til assays af enzymaktivitet i vandprøver, der giver nær øjeblikkelige resultater, på…

Materials

			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers