Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Summary

Procedimentos em microplacas são descritos para a análise colorimétrica ou fluorimétrica da atividade da enzima extracelular. Estes procedimentos permitem o rápido ensaio de tal atividade em um grande número de amostras ambientais dentro de um prazo administrável.

Abstract

Grande parte da ciclagem de nutrientes e processamento de carbono em ambientes naturais ocorre através da atividade de enzimas extracelulares produzidos por microorganismos. Assim, a medição da atividade dessas enzimas extracelulares pode dar insights sobre as taxas de processos de nível do ecossistema, como a decomposição da matéria orgânica ou de azoto e de mineralização do fósforo. Os ensaios de actividade da enzima extracelular em amostras ambientais tipicamente envolver a exposição das amostras de substratos colorimétricos ou fluorométricos artificiais e rastreando a taxa de hidrólise do substrato. Aqui nós descrevemos os métodos em microplacas para estes procedimentos que permitem a análise de um grande número de amostras dentro de um curto espaço de tempo. As amostras são deixados reagir com substratos artificiais dentro microplacas de 96 poços ou de poço profundo blocos de microplacas, e a actividade da enzima é subsequentemente determinada por absorção ou fluorescência do produto final resultante utilizando uma microplaca Reade típicor ou fluorímetro. Tais procedimentos de alto rendimento não só facilitar as comparações entre os locais ou ecossistemas espacialmente separadas, mas também reduzir substancialmente o custo de tais ensaios, reduzindo os volumes totais de reagentes necessários por amostra.

Introduction

Os microrganismos, tais como bactérias e fungos obter nutrientes e de carbono a partir de compostos orgânicos complexos, através da produção de enzimas extracelulares. Estas enzimas normalmente hidrolisar polímeros em subunidades menores que podem ser tomadas para a célula. Portanto, a nível ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos são responsáveis ​​por grande parte da mineralização de nutrientes e decomposição da matéria orgânica, que ocorre em ambientes naturais. Enzimas tais como celobiohidrolase (CBH) e β-glucosidase são importantes para a degradação da celulose e do trabalho em uníssono para catalisar a hidrólise da celulose em glicose ^1,2, o que proporciona um substrato de carbono utilizáveis ​​para a absorção e assimilação microbiana. A fosfatase enzima libera grupos fosfatos inorgânicos solúveis de organofosforados, essencialmente mineralização de fosfato e tornando-o disponível para uso pela maioria dos organismos ^3. Outros enzimas, tais como a N-acetilglucosaminidase (NAGase), são important na degradação da quitina e pode fazer tanto carbono e nitrogênio disponível para aquisição microbiana ^4.

Um dos procedimentos para o ensaio da atividade enzimática extracelular microbiana em ambientes naturais é o uso de p-nitrofenil artificial (p NP) substratos ligados, uma abordagem que foi originalmente desenvolvido para detectar a atividade da fosfatase do solo ^5. Esta abordagem baseia-se na detecção de um produto final colorido, p-nitrofenol, o qual é libertado, quando o substrato artificial é hidrolisado pela enzima apropriada. O p-nitrofenol pode ser subsequentemente quantificados colorimetricamente através da medição da sua absorvância de cerca de 400-410 nm. Este método já foi utilizada para a detecção de outras enzimas tais como a NAGase ^6, e tem sido utilizado em vários estudos procurando a actividade enzimática extracelular microbiana no solo e nos sedimentos ^7-9.

Uma abordagem alternativa que era originally desenvolvido para avaliar a actividade de glicosidase extracelular em ambientes aquáticos ^10,11 faz uso de 4-metilumbeliferona (MUB) substratos ligados. O produto final libertada (4-metilumbeliferona) é altamente fluorescente e pode ser detectada usando um fluorómetro, com uma configuração de excitação / emissão em torno de 360/460 nm. Uma variedade de substratos artificiais MUB-ligadas estão disponíveis, permitindo a medição fluorométrico da actividade de, pelo menos, como muitas enzimas (por exemplo, β-glicosidase, celobiohidrolase, Nagase, fosfatase), como pode ser testada utilizando o procedimento colorimétrico NP-substrato p. Outras enzimas extracelulares microbianos, tais como a leucina-aminopeptidase proteína-degradante, pode ser ensaiada fluorometricamente utilizando 7-amino-4-metilcumarina (COU) substratos ligados. Ambos MUB-e substratos COU-ligados foram utilizados para determinar a actividade da enzima em diferentes amostras terrestres e aquáticos ^12,13.

Embora estudos anteriores têm described microplaca fluorométrica ou colorimétrico abordagens para determinar a atividade da enzima extracelular ^14, há uma necessidade de uma apresentação clara de como conduzir tais ensaios. Aqui demonstramos procedimentos para a realização de técnicas de alto rendimento de microplacas para a análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos, utilizando a abordagem de substratos ligados ao NP p colorimétrico e em águas naturais usando o MUB fluorescente ligada técnica substratos. Nós nos concentramos na medição das atividades de β-glicosidase, NAGase e fosfatase como essas enzimas pode ser amarrado ao carbono, nitrogênio, fósforo e ciclismo, respectivamente. No entanto, os processos descritos aqui podem ser aplicados para a medição de outras enzimas extracelulares usando diferentes substratos artificiais.

Protocol

Colorimétrico Análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos 1. Preparação do Substrato e Soluções Tampão de Análises colorimétrica de atividade enzimática H preparar 50 mM de tampão de acetato (pH 5,0-5,5) por mistura de 50 ml de 0,1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial em 500 ml de água), 150 ml de 0,1 M de acetato de sódio, e 200 ml de água destilada 2 O. Ajustar o pH para 5,0-5,5 com ácido acético 0,1 M, se necess?…

Representative Results

Solos e sedimentos aquáticos têm tipicamente níveis apreciáveis ​​de actividade da enzima extracelular, como resultado de comunidades microbianas acoplados (biofilmes) que crescem na superfície das partículas. Figura 3 mostra como esta actividade muda dependendo do tamanho das partículas obtidas a partir da superfície do sedimento de um terceiro fluxo de ordem no norte Mississippi, EUA. Um estudo anterior demonstrou que as comunidades bacterianas em partículas de sedimentos deste fluxo pode…

Discussion

Determinar a atividade de uma variedade de enzimas extracelulares microbianas em solos e sedimentos pode fornecer informações úteis sobre as taxas de mineralização de nutrientes e processamento de matéria orgânica ^17. No entanto, os solos podem variar em seus níveis de umidade, por isso é importante para padronizar a atividade de peso seco de solo. Isso requer uma etapa de secagem adicional (normalmente de dois dias) além de simplesmente medir a atividade da enzima. Assim, em contraste com os ensaio…

Materials

			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers