माउस रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं में Synaptic और कृत्रिम conductances साथ गतिशील क्लैंप को लागू
Summary
इस वीडियो लेख सेल शरीर पैच करने के लिए सेट अप, प्रक्रियाओं और कैसे पूरे माउंट माउस दृष्टिपटल में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं से गतिशील दबाना रिकॉर्डिंग को लागू करने के लिए दिखाता है. इस तकनीक को उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी आदानों की सटीक योगदान की जांच, और neuronal spiking के लिए उनके रिश्तेदार परिमाण और समय की अनुमति देता है.
Abstract
नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं रेटिना के उत्पादन न्यूरॉन्स होते हैं और उनकी गतिविधियों विशिष्ट तंत्रिका सर्किट से उत्पन्न होने वाली कई अन्तर्ग्रथनी आदानों के एकीकरण को दर्शाता है. वोल्टेज दबाना और वर्तमान दबाना विन्यास में पैच दबाना तकनीक,, आमतौर पर न्यूरॉन्स के शारीरिक गुणों का अध्ययन करने और उनके अन्तर्ग्रथनी आदानों चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन तकनीकों का प्रयोग बहुत जानकारीपूर्ण है, वे विभिन्न सीमाओं मुद्रा. उदाहरण के लिए, यह उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों की सटीक बातचीत प्रतिक्रिया उत्पादन का निर्धारण कैसे अंदाजा लगाना मुश्किल है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम भी प्रवाहकत्त्व दबाना 1, 2, 3 नामक एक संशोधित वर्तमान दबाना तकनीक, गतिशील दबाना, इस्तेमाल किया और neuronal excitability पर उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी आदानों के प्रभाव की जांच की. इस तकनीक को सेल में वर्तमान के इंजेक्शन की आवश्यकता है और उस समय इसकी झिल्ली क्षमता का वास्तविक समय प्रतिक्रिया पर निर्भर है. injecteघ मौजूदा पूर्व निर्धारित उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी conductances, उनके उलट क्षमता और सेल की तात्कालिक झिल्ली क्षमता से गणना की है. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पर विवरण, गतिशील दबाना तकनीक के एक पूरे सेल विन्यास और रोजगार प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं clamping पैच इस वीडियो लेख में सचित्र हैं. यहाँ, हम नियंत्रण की स्थिति में या दवाओं की उपस्थिति में शारीरिक प्रयोगों से प्राप्त विभिन्न प्रवाहकत्त्व waveforms के लिए माउस रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं दिखा. इसके अलावा, हम कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए अल्फा कार्यों का उपयोग कर उत्पन्न कृत्रिम उत्तेजक और निरोधात्मक conductances के इस्तेमाल को दिखाने के.
Introduction
रेटिना आंख के पीछे अस्तर एक लगभग पारदर्शी तंत्रिका ऊतक है. कई अध्ययनों से पहले दृश्य प्रसंस्करण में कदम और synaptic संकेत के तंत्र की जांच करने के लिए मॉडल के रूप में रेटिना का उपयोग करें. पूरे माउंट तैयारी में रेटिना नेटवर्क विच्छेदन के बाद भी बरकरार है, यह अपनी शारीरिक प्रतिक्रियाओं vivo परिस्थितियों में बहुत सी समानताएँ हैं के रूप में synaptic बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श व्यवस्था का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रकार, अपने न्यूरॉन्स के गुण पैच दबाना तकनीक (तकनीक पर समीक्षा के लिए, 6,9,13 देखें) का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है एक अलग रेटिना का उपयोग कर. औषधीय एजेंटों के विभिन्न स्थलों पर कार्य के रूप में विशिष्ट सर्किट और नाड़ीग्रन्थि सेल प्रतिक्रिया के लिए न्यूरोट्रांसमीटर की सटीक योगदान की पहचान है, तथापि, आमतौर पर रुकावट है.
प्रकाश को रेटिना न्यूरॉन्स की शारीरिक प्रतिक्रियाओं, प्राकृतिक उत्तेजना, intracellular द्रव से भरा गिलास pipettes के साथ दर्ज किया जा सकता है. पैच सीएल का उपयोगamp, तकनीक, प्रकाश उत्तेजना के लिए neuronal प्रतिक्रियाओं झिल्ली संभावित उतार चढ़ाव (वर्तमान दबाना) के रूप में या धाराओं (वोल्टेज दबाना) के रूप में दर्ज किया जा सकता है. विभिन्न voltages पर झिल्ली संभावित पकड़ रहा है और एक अनुमान प्रवाहकत्त्व विश्लेषण लागू करने से, यह निरोधात्मक और उत्तेजक अन्तर्ग्रथन आगतों 5,12 अलग करना संभव है. प्रयोगों के इस प्रकार के सामान्य स्नान मध्यम में और विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर और neuronal प्रतिक्रियाओं को रिसेप्टर्स के योगदान को अलग करने के लिए विभिन्न औषधीय एजेंटों की उपस्थिति में किया जा सकता है. कई प्रयोगशालाओं से अध्ययन का एक धन spiking उत्पादन और प्रोत्साहन ऐसे आकार के रूप में गुण, इसके विपरीत, स्थानिक और लौकिक आवृत्तियों, दिशा, अभिविन्यास और अन्य प्रोत्साहन चर पर उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों की निर्भरता होती है. इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण कील उत्पादन और प्रोत्साहन संपत्तियों के एक समारोह के रूप में अन्तर्ग्रथनी सूचनाओं के बीच रिश्ते के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं,सेल excitability के लिए विशेष प्रकार की कोशिकाओं और उनके अन्तर्ग्रथनी आदानों के योगदान की व्याख्या स्पष्ट नहीं है. यह आम तौर पर उत्तेजक और निरोधात्मक दोनों आदानों प्रोत्साहन गुणों के साथ बदलती हैं और इस प्रकार, यह इन सूचनाओं के दोनों में परिवर्तन neuronal spiking पर है कि सटीक प्रभाव का आकलन करने के लिए संभव नहीं है कि इस तथ्य के कारण है.
इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण उत्पादन spiking के लिए व्यक्तिगत अन्तर्ग्रथनी आदानों के योगदान का एक महत्वपूर्ण मूल्यांकन की अनुमति जो गतिशील दबाना रिकॉर्डिंग, बाहर ले जाने के लिए है. गतिशील दबाना तकनीक सेल में वर्तमान के प्रत्यक्ष इंजेक्शन की अनुमति देता है और एक निश्चित समय पर मौजूदा इंजेक्शन की राशि उस समय 1,2,3 (समीक्षा के लिए, 7,14 देखें) में दर्ज की झिल्ली की क्षमता पर निर्भर करता है. यह एक संशोधित वर्तमान दबाना सेट अप है जहां रिकॉर्डिंग के तहत सेल और विशेष हार्डवेयर शामिल उपकरण, सॉफ्टवेयर के बीच एक वास्तविक समय, तेजी से प्रतिक्रिया बातचीतऔर एक कंप्यूटर हासिल की है. सेल में मौजूदा इंजेक्शन की मात्रा के हिसाब से गणना की जाती है. इसलिए, इस विधि का लाभ सेल प्रवाहकत्त्व waveforms के विभिन्न संयोजनों के साथ प्रेरित किया जा सकता है, और अपनी प्रतिक्रिया अन्तर्ग्रथनी आदानों कि मध्यस्थता रिसेप्टर्स की सक्रियण की नकल करेंगे. उदाहरण के लिए, एक छोटी सी जगह के लिए उत्तेजक प्रवाहकत्त्व के इंजेक्शन के जवाब के साथ एक छोटी सी जगह के लिए उत्तेजक और निरोधात्मक conductances के इंजेक्शन के जवाब की तुलना केवल सेल प्रतिक्रिया पर निषेध के प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इसी तरह, physiologically दर्ज conductances के अन्य संयोजन कील उत्पादन को प्रभावित कैसे प्रेरणा पर निर्भर उत्तेजक और / या निरोधात्मक conductances में परिवर्तन प्रकट करने के लिए सह इंजेक्शन जा सकता है.
हमारे अध्ययन में, गतिशील दबाना तकनीक रिश्तेदार आयाम और रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की फायरिंग गुण पर अन्तर्ग्रथनी आदानों के समय के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विभिन्न conductancesनियंत्रण की स्थिति में या औषधीय एजेंटों की उपस्थिति में शारीरिक प्रयोगों से प्राप्त जानकारी के रूप में कार्यरत थे. इसके अलावा, अल्फा कार्यों के आधार पर कृत्रिम conductances भी अन्तर्ग्रथनी आदानों न्यूरॉन्स द्वारा एकीकृत कर रहे हैं कि कैसे की जांच के क्रम में इस्तेमाल किया गया. इस प्रकार इस प्रवाहकत्त्व के विभिन्न प्रकार के औषधीय या computationally ही नाड़ीग्रन्थि सेल में इंजेक्ट किया, या तो physiologically उत्पन्न, इन सूचनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं की तो तुलना बनाया जा सकता है की अनुमति देता है कि एक बहुमुखी तकनीक है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम अनुपात और उत्तेजना और रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल उत्पादन पर निषेध के रिश्तेदार समय के प्रभाव का आकलन करने के लिए गतिशील क्लैंप के उपयोग दिखा. गतिशील दबाना रहने वाले न्यूरॉन्स में physiologically दर्ज या क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम बायोमेडिकल साइंस के अनुशासन से ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी DP0988227) और जैव चिकित्सा विज्ञान अनुसंधान पहल अनुदान, सिडनी विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है. उपकरण पैच दबाना एम्पलीफायर ईपीसी 8 बायोमेडिकल साइंस, सिडनी विश्वविद्यालय के अनुशासन से स्टार्टअप कोष द्वारा वित्त पोषित किया गया. उपकरण InstruTECH LIH 8 +8 डाटा अधिग्रहण प्रणाली रेबेका एल कूपर फाउंडेशन और बायोमेडिकल साइंस, सिडनी विश्वविद्यालय के अनुशासन से स्टार्टअप कोष से धन के साथ खरीदा गया था. हम उनके व्यावहारिक सुझावों और टिप्पणियों के लिए अनाम समीक्षक धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
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