Implementering Dynamic Clamp med Synaptic og kunstig conductances i mus retinal ganglion celler
Summary
Denne videoen artikkelen illustrerer de set-up, prosedyrene for å lappe celle organer og hvordan å implementere dynamiske klemme opptak fra ganglion celler i hel-mount mus retinae. Denne teknikken gjør etterforskningen av den nøyaktige bidraget av eksitatoriske og hemmende synaptiske innganger, og deres relative størrelse og timing til neuronal skyter.
Abstract
Ganglieceller er utgangs-nevroner i retina og deres aktivitet reflekterer integrasjon av flere synaptiske innganger som oppstår fra bestemte neurale kretser. Patch clamp teknikker, i spenning klemme og nåværende klemme konfigurasjoner, blir ofte brukt til å studere de fysiologiske egenskapene til nerveceller og å karakterisere sine synaptiske innganger. Selv om anvendelsen av disse teknikkene er svært informativ, utgjør de ulike begrensninger. For eksempel er det vanskelig å kvantifisere hvor de nøyaktige interaksjoner av stimulerende og hemmende innganger bestemme responsen utgang. For å løse dette problemet, har vi brukt en modifisert strømtangsett teknikk, dynamisk klemme, også kalt ledningsevne en klemme, 2, 3 og undersøkt effekten av eksitatoriske og hemmende synaptiske innganger på neuronal oppstemthet. Denne teknikken krever innsprøyting av strøm inn i cellen, og er avhengig av den sanntids tilbakemelding av dens membran potensial på det tidspunktet. Den injected strøm er beregnet ut fra forhåndsbestemte eksitatoriske og hemmende synaptiske conductances, deres reversering potensialer og cellens momentant membran potensial. Detaljer på de eksperimentelle prosedyrer, blir lappen fastspenning cellene for å oppnå en hel-celle-konfigurasjon og anvendelse av den dynamiske klemmen teknikk illustrert i denne video-artikkelen. Her viser vi svarene av mus retinal ganglion celler til ulike ledningsevne kurver hentet fra fysiologiske eksperimenter i kontroll forhold eller i nærvær av narkotika. Videre viser vi bruk av kunstige eksitatoriske og hemmende conductances generert ved hjelp av alfa-funksjoner for å undersøke svarene på cellene.
Introduction
Retina er en nær-gjennomsiktig nervevev som forer baksiden av øyet. Mange studier bruker netthinnen som modell for å undersøke de første trinnene i visuell prosessering og mekanismer av synaptiske signalering. Siden retinal nettverket i hel-mount forberedelse er intakt etter disseksjon, representerer det et ideelt system for å studere synaptiske interaksjoner som sine fysiologiske responser er svært lik den in vivo forhold. Dermed bruker en isolert netthinnen egenskapene til sine nerveceller kan studeres ved hjelp av patch clamp teknikker (for anmeldelser på teknikken, se 6,9,13). Identifikasjon av den eksakte bidraget av særskilte kretser og nevrotransmittere til ganglion-cellerespons, men er vanligvis hindrede som farmakologiske midler opptrer på forskjellige steder.
Fysiologiske responser av netthinnens nerveceller til lys, naturlig stimulans, kan tas opp med glass pipetter fylt med intracellulær væske. Ved hjelp av patch clamp teknikker, nevrale responser til lys stimulering kan bli registrert som membran potensielle svingninger (strømtang) eller som strømmer (spenning klemme). Ved å holde membranen potensiell på ulike spenninger og implementere en posteriori konduktans analyse, er det mulig å isolere inhiberende og eksitatorisk synaptisk innganger 5,12. Slike eksperimenter kan utføres i normal bading medium og i nærvær av forskjellige farmakologiske midler for å isolere bidraget fra forskjellige nevrotransmittere og reseptorer for nevronal responser. Et vell av studier fra mange laboratorier preget avhengighet av spiking produksjon og eksitatoriske og hemmende innganger på stimulans egenskaper som størrelse, kontrast, romlige og tidsmessige frekvenser, retning, orientering og andre stimuleringstiltak variabler. Selv om disse eksperimentelle tilnærminger gi informasjon om forholdet mellom pigg-utgang og synaptiske innganger som funksjon av stimulus egenskaper,tolkning av bidraget av spesifikke celletyper og deres synaptiske innganger til celleeksiterbarhet er ikke enkelt. Dette skyldes det faktum at typisk både stimulerende og hemmende innganger variere med stimulus egenskaper og således er det ikke mulig å vurdere den nøyaktige virkningen at endringer i begge disse innganger har på neuronal spiking.
En alternativ tilnærming til å omgå disse begrensningene er å utføre dynamiske klemme innspillinger, som tillater en kritisk vurdering av bidraget fra enkelte synaptiske innganger til spiking utgang. Den dynamiske klemmen teknikken tillater direkte injeksjon av strøm inn i cellen og mengden av strøm injisert ved et gitt tidspunkt avhenger av den innspilte membranpotensialet på det tidspunktet 1,2,3 (for gjennomgang, se 7,14). Det er en modifisert strømtangen oppsett hvor en sanntids tilbakemelding rask interaksjon mellom cellen under innspilling og utstyret bestående av spesialisert maskinvare, programvareog en datamaskin er oppnådd. Mengden av strøm injisert inn i cellen beregnes deretter. Derfor, er fordelen med denne metode at cellen kan stimuleres med forskjellige kombinasjoner av konduktans bølgeformer, og dens reaksjon vil etterligne aktivering av reseptorer som medierer synaptisk innganger. For eksempel gir sammenligning av svar på injeksjon av eksitatoriske og hemmende conductances for en liten flekk med responsen på injeksjon av eksitatoriske ledningsevne for en liten flekk bare informasjon om effekten av hemming på celle respons. Likeledes kan andre kombinasjoner av fysiologisk registrert conductances være co-injiseres for å avsløre hvordan stimulus-avhengige endringer i eksitatoriske og / eller hemmende conductances påvirke pigg utgang.
I vår studie er det dynamiske klemme teknikk som brukes til å demonstrere effekten av den relative amplitude og timing av synaptiske innganger på standplass egenskaper retinal ganglion celler. Ulike conductanceshentet fra fysiologiske eksperimenter i kontroll forhold eller i nærvær av farmakologiske midler ble ansatt som innganger. I tillegg ble det kunstige conductances basert på alfa-funksjoner også brukes for å undersøke hvordan synaptiske innganger er integrert av nerveceller. Dermed er dette en allsidig teknikk som tillater forskjellige typer av konduktans genereres enten fysiologisk, farmakologisk eller beregningsmessig som skal injiseres i den samme ganglion cellen, kan så sammenligning av responser på disse inngangene gjøres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser bruken av dynamisk klemme for å bedømme innflytelsen av forholdet og relative tidspunkt for eksitasjon og hemming på retina-ganglion celle utgang. Dynamisk klemme gjør bruk av datasimulering til å innføre fysiologisk innspilte eller kunstig synaptiske conductances i levende nerveceller. Denne metoden gir et interaktivt verktøy der conductances kan endres og injiseres i nevroner for å beregne sin innflytelse på nevrale responser. Konduktans bølgeformer kan fås fra eksperimenter hvor visuelle stimuli …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av Australian Research Council (ARC DP0988227) og Biomedical Science Research Initiative Grant fra Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Utstyret Patch Clamp Forsterker EPC 8 ble finansiert av Startup fondet fra Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Utstyret InstruTECH LIH 8 +8 Data Acquisition System ble kjøpt med midler fra Rebecca L. Cooper Foundation og Startup Fund fra Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Vi vil gjerne takke de anonyme anmeldere for sine innsiktsfulle innspill og kommentarer.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
