マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装
Summary
このビデオの記事では、セットアップの細胞体とどのように全体のマウントマウス網膜における神経節細胞からのダイナミッククランプ記録を実装するにパッチを適用する手順を示しています。この手法は、興奮性と抑制性シナプス入力の正確な貢献の調査、および神経スパイクに対する相対的な大きさとタイミングを可能にします。
Abstract
神経節細胞は、網膜の出力ニューロンであり、その活性は、特定の神経回路から生じる複数のシナプス入力の統合を反映している。パッチクランプ技術は、電圧クランプ、電流クランプ構成では、一般に神経細胞の生理学的特性を研究し、そのシナプス入力を特徴付けるために使用される。これらの技術の適用は非常に有益であるが、それらは様々な制限をもたらす。例えば、興奮性および抑制性入力の正確な相互作用が応答出力を決定する方法を定量化することは困難である。この問題に対処するために、我々はコンダクタンスクランプ1、2、3とも呼ばれる修正された電流クランプ法、動的クランプを使用し、神経細胞の興奮性に興奮性および抑制性シナプス入力の影響を検討した。この技術は、セルに電流注入を必要とし、その時の膜電位のリアルタイムフィードバックに依存する。 injectedは電流が所定の興奮性および抑制性シナプスコンダクタンス、その反転電位とセルの瞬間的な膜電位から計算される。実験手順の詳細については、ダイナミッククランプ法の全細胞の構成と雇用を達成するために、細胞をパッチクランプは、このビデオの記事に示されている。ここでは、制御条件または薬物の存在下における生理学的実験から得られた様々なコンダクタンスの波形にマウス網膜神経節細胞の応答を示している。さらに、細胞の応答を調べるために、αの関数を用いて生成された人工興奮性および抑制性のコンダクタンスの使用を示す。
Introduction
網膜は、眼の後部に並ぶ近透明な神経組織である。多くの研究では、視覚処理とシナプス伝達のメカニズムの最初のステップを検討するモデルとして網膜を使用しています。ホールマウントの準備における網膜ネットワークは解剖後に無傷のままであるので、その生理反応がインビボ条件下に非常に類似しているとして、シナプスの相互作用を研究するための理想的なシステムを表しています。したがって、そのニューロンの特性はパッチクランプ技術（技術の上でレビューのために、6,9,13を参照）を使用して研究することができる孤立網膜を用いた。薬剤は、様々な部位に作用するような特定の回路や神経節細胞応答に神経伝達物質の正確な寄与の同定は、しかしながら、通常は妨げられる。
光に網膜神経細胞の生理学的反応、自然な刺激が、細胞内液で満たされたガラスピペットで記録することができます。パッチCLを使用してアンプ技術、光刺激に対するニューロンの応答は、膜電位変動（電流クランプ）または電流（電圧クランプ）として記録することができます。異なる電圧で膜電位を保持し、 事後コンダクタンス分析を実施することにより、抑制性および興奮性シナプス入力5,12を単離することができる。実験のこのタイプは、通常の入浴中に、異なる神経伝達物質および神経応答に対する受容体の寄与を分離するために、異なる薬剤の存在下で行うことができる。多くの研究室からの研究の富は、このような大きさ、コントラスト、空間的および時間周波数、方向、向きや他の刺激変数として刺激特性に出力し、興奮性と抑制性の入力をスパイクの依存性を特徴としている。これらの実験的なアプローチは刺激特性の関数としてスパイク出力とシナプス入力との間の関係に関する情報を提供していますが、細胞の興奮に、特定の細胞の種類とそのシナプス入力の寄与の解釈は簡単ではありません。これは、典型的に興奮性および抑制両方の入力が刺激特性によって異なり、したがって、それはこれらの入力のいずれかの変化は神経スパイクに与える正確な影響を評価することができないという事実によるものである。
これらの制限を回避する別のアプローチは、出力スパイクへの個々のシナプス入力の貢献の重要な評価を可能にするダイナミッククランプ記録を実施することである。ダイナミッククランプ法は、セルへの電流の直接注入を可能にし、所定の時間に注入される電流の量はその時1,2,3（レビューのために、7,14を参照）に記録された膜電位に依存します。これは、修正された電流クランプセットアップです記録の下のセルと専用のハードウェアを備えた機器、ソフトウェア間のリアルタイム、高速フィードバックインタラクションコンピュータが達成される。細胞に注入される電流の量はそれに応じて計算される。したがって、この方法の利点は、セルがコンダクタンス波形の異なる組み合わせで刺激することができ、その応答はシナプス入力を媒介受容体の活性を模倣することである。例えば、小さなスポット用興奮コンダクタンスの注入への応答で小さなスポット用の興奮性と抑制コンダクタンスの注入への応答の比較のみ細胞応答に対する阻害の影響に関する情報を提供します。同様に、生理的に記録されたコンダクタンスの他の組み合わせは、スパイクが出力にどのように影響するかを刺激依存性興奮性および/または抑制性コンダクタンスの変化を明らかにするために同時注入することができます。
我々の研究では、動的クランプ技術は、相対振幅および網膜神経節細胞の発火特性にシナプス入力のタイミングの影響を実証するために使用される。さまざまなコンダクタンス制御条件、または薬理学的薬剤の存在下における生理学的実験から得られた入力として用いた。また、アルファ関数に基づく人工コンダクタンスはまた、シナプス入力がニューロンによって一体化されている方法を調査するために使用された。したがって、このコンダクタンスは様々な種類の薬理学的又は計算的に同一の神経節細胞に注入される、いずれかの生理学的に生成され、これらの入力に対する応答のように比較を行うことができることができる汎用性の高い技術である。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、比の影響と網膜神経節細胞の出力に興奮と抑制の相対的なタイミングを評価するためのダイナミック·クランプを使用することを示しています。ダイナミッククランプは生きているニューロンに生理的に記録されたまたは人工シナプスコンダクタンスを導入するためのコンピュータシミュレーションを利用しています。この方法論はコンダクタンスが変更され、ニューロンの応答?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、オーストラリア研究会議（ARC DP0988227）とバイオメディカルサイエンスの調教からバイオメディカルサイエンス研究イニシアティブ助成、シドニー大学でサポートされています。機器のパッチクランプアンプEPC 8はバイオメディカルサイエンスの調教からスタートアップ基金、シドニー大学によって資金を供給された。機器InstruTECH LIH 8 +8データ収集システムは、レベッカL.クーパー財団とバイオメディカルサイエンスの調教からスタートアップ基金、シドニー大学からの資金で購入した。我々は彼らの洞察に満ちた提案やコメントのために匿名の査読に感謝したいと思います。
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
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