גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן
Summary
מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.
Abstract
מאמצים משמעותיים נאספו ליצירת מפות רשת אינטראקציה בין חלבונים מקיפות בקנה מידה גדולה. זו היא סייעה להבין את יחסי פתוגן-מארחים ולמעשה בוצעה על ידי הקרנות גנטיות בשמרים שתי מערכות היברידיות. השיפור האחרון של זיהוי אינטראקציה בין חלבונים על ידי assay שלמת בר מבוסס לוציפראז Gaussia מציע כעת את ההזדמנות לפתח גישות interactomic השוואתיות אינטגרטיביים הדרושים על מנת להשוות בקפדנות פרופילי אינטראקציה של חלבונים מגרסות זן פתוגן שונים נגד מערך משותף של גורמים הסלולר.
מאמר זה מתמקד באופן ספציפי את השירות של שילוב של שתי שיטות מאונך ליצירת מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים: שמרי שני היברידי (Y2H) ובדיקה חדש, assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps חלבון שלמה (HT-GPCA) שבוצע בתאי יונקים.
NT "> זיהוי בקנה מידה גדול של שותפים הסלולר של חלבון הפתוגן מבוצע על ידי הזדווגות מבוססת שמרי הקרנות שתי היברידיות של ספריות cDNA באמצעות גרסאות זן פתוגן מרובות. משנה של שותפים באינטראקציה שנבחרו על ניקוד ברמת הוודאות גבוהה הוא סטטיסטי נוסף תוקף בתאי יונקים לאינטראקציות חכמות זוג עם המערך השלם של חלבוני גרסאות פתוגן באמצעות HT-GPCA. זה שילוב של שתי שיטות משלימות משפר את חוסנו של מערך יחסי הגומלין, ומאפשר ביצועים של ניתוח השוואתי אינטראקציה מחמירה. interactomics השוואתי כאלה מהווה אסטרטגיה אמינה וחזקה לפענח כל interplays הפתוגן-מארח.Introduction
הכמות הולכת והגדלה של נתונים שנאספו כדי ליצור מפות אינטראקציה בין חלבונים פותחת אופקים כדי להבין עוד יותר זיהומי הפתוגן. ככל שהבנה הגלובלית של זיהומי פתוגן מתחילה להתגלות, הוא מספק גישה למגוון של הפרעות הנגרמות על ידי חלבוני גורמי מחלה בעת חיבור proteome האנושי 1. זה ובכך מציע דרך כדי להבין איך לתפעל את מכונות פתוגנים התא המארחת. בפרט, המיפוי של מספר רשתות אינטראקציה ויראלי-מארחות גילה כי חלבונים נגיפיים מעדיפים למקד חלבונים מארחים שהם מאוד מחוברים ברשת הסלולרית (רכזות), או שהם מרכזיים בנתיבים רבים ברשת (חלבוני צווארי בקבוק) 2-4. אינטראקציות אלה מאפשרים לוירוסים כדי לתפעל תהליכים תאיים חשובים, אשר היא סייע לשכפל ולייצר צאצאים מדבקים. מיפוי אינטראקציות השוואתי שנערכו לאחרונה על וירוסים הקשורים במטרה לחלץ מידע ביחס לפתוגנזה 4. יתר על כן, מחקרים של הנוף מארח פתוגנים האינטראקציות שהורחבו לפתוגנים רבים 5. זיהוי הגורמים ממוקד התא מספק תובנות האסטרטגיות בשימוש על ידי פתוגנים להדביק תאים ומאפשר זיהוי של סמנים פתוגניים פוטנציאליים.
המערכת דו היברידי השמרים היא השיטה הפופולרית ביותר לזיהוי אינטראקציות בינאריים מאז סריקות גנטיות היא כלי יעיל ורגיש למיפוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים. הגישה מוצעת כאן עוד יותר משפר את הקרנות Y2H בודדות על ידי הערכת חלבון של גרסאות זן פתוגנים רבות, המספק גישה לסקירה השוואתית של אינטראקציות בין חלבונים הפתוגן-מארחים וכך. יתר על כן, מגבלה עיקרית של הקרנת שתי היברידי שמרים טמון בשיעור שגוי שלילי גבוה, מאחר שהוא מתאושש כ -20% מאינטראקציות סה"כ 6. משמעות הדבר הוא כי אינטראקציות עם אותרו רק קבוצת משנה של פתיוגרסאות גנס אולי חמקו מזיהוי עם האחרים. לכן, שותפים בודדים המתעוררים מכל ההקרנות של שתי ההיברידיות מאותגרים עוד יותר לאינטראקציה עם מגוון רחב של זנים למדו מלא, ומספקים מערכי נתונים השוואתיים אינטראקציה. מאז שהוכיח כי שילוב מתודולוגיות שונות מגביר משמעותי את החוסן של מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים 7, אימות זה מבוצעת בתאי יונקים ידי assay שלמת חלבון שבר חדש שפותח בשם HT-GPCA 8. מערכת מבוססת תא זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון על ידי שלמה של Princeps Gaussia לפצל לוציפראז ותוכנן כך שיתאים לפורמט תפוקה גבוהה. הודות לטכנולוגיה המבוססת על הארה שלה ורעש הרקע הנמוך שלה בהשוואה לassay הקרינה מבוססת אחרים, HT-GPCA מציג רגישות גבוהה להפליא.
באופן כללי, גישה זו מהווה יעילהכלי ליצירת מיפוי מקיף של interplays מאכסן לפתוגן, המייצג את הצעד הראשון לקראת הבנה גלובלית של התא המארח חטיפה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באופן עצמאי, שמרים, שני מבחני אינטראקציה היברידיים ויונקים, כגון GST הנפתח, LUMIER או MAPPIT, הוכיחו להיות כלים יעילים לאיתור חלבונים אינטראקציות, אבל מוגבלים על ידי השיעור הגבוה של חיובית שגוי וכוזב שליליים אינטראקציות קשורות לטכניקות אלה 15. יתר על כן, ראיות הולכות וג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון מהמכון פסטר ועל ידי מענקים מLigue Nationale contre le הסרטן (מענקי R05/75-129 וRS07/75-75), איגוד pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן (מענקים ARC A09 / 1/5031 ו4867), וסוכנות הידיעות Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 וANR09 הבעת 026 01). MM היה מקבל מלגת MENRT.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
