A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات
Summary
تركز هذه المقالة على تحديد مجموعات البيانات التفاعل ثقة عالية بين المضيف والممرض البروتينات باستخدام مزيج من طريقتين متعامد: الخميرة اثنين الهجين تليها مقايسة تفاعل عالية الإنتاجية في خلايا الثدييات يسمى HT-GPCA.
Abstract
جمعت جهودا كبيرة لتوليد خرائط شاملة واسعة النطاق البروتين البروتين شبكة التفاعل. هذا هو دور أساسي لفهم العلاقات الممرض المضيف وأجريت أساسا عن طريق غربلة وراثية في الخميرة أنظمة هجين اثنين. التحسن الأخير من الكشف عن البروتين البروتين التفاعل من قبل Gaussia جزء المستندة إلى luciferase الفحص تكامل تقدم الآن فرصة لتطوير المناهج interactomic النسبية التكاملية اللازمة لمقارنة بدقة ملامح تفاعل بروتينات مختلفة من المتغيرات سلالة الممرض ضد مجموعة مشتركة من العوامل الخلوية.
وتركز هذه الورقة على وجه التحديد على فائدة الجمع بين طريقتين متعامد لتوليد البروتين البروتين مجموعات البيانات التفاعل: الخميرة اثنين الهجين (Y2H) وفحص جديدة، عالية الإنتاجية Gaussia princeps البروتين مقايسة تكامل (HT-GPCA) التي أجريت في خلايا الثدييات.
NT "يتم تنفيذ> A تحديد نطاق واسع من الشركاء الخلوية من البروتين الممرض عن طريق التزاوج القائم على الخميرة غربلة هجين اثنين من مكتبات [كدنا] باستخدام عدة متغيرات سلالة الممرض. مجموعة فرعية من الشركاء التفاعل اختيارها على التهديف الثقة العالية الإحصائية مزيد التحقق من صحة في خلايا الثدييات للتفاعل الزوج الحكيم مع مجموعة كاملة من المتغيرات الممرض البروتينات باستخدام HT-GPCA. هذا مزيج من اثنين من الطرق التكميلية يحسن متانة ورقة العمل التفاعل، ويسمح للأداء صرامة تحليل التفاعل المقارنة. هذه interactomics المقارنة تشكل استراتيجية موثوق بها وقوية على فك أي interplays الممرض المضيف.Introduction
كمية متزايدة من البيانات التي تم جمعها لتوليد خرائط التفاعل البروتين البروتين يفتح آفاقا لمزيد من فهم التهابات الممرض. كما الفهم العالمي لالتهابات الممرض تبدأ في الظهور، فإنه يوفر الوصول إلى مجموعة من الاضطرابات الناجمة عن مسببات الأمراض البروتينات عند توصيل بروتيوم الإنسان 1. وبذلك يوفر وسيلة لفهم كيفية التعامل مع مسببات الأمراض آلية الخلية المضيفة. على وجه الخصوص، كشفت رسم الخرائط من عدة شبكات التفاعل الفيروسي المضيف أن البروتينات الفيروسية استهداف تفضيلي البروتينات المضيفة التي ترتبط بشكل كبير في الشبكة الخلوية (المحاور)، أو التي تعتبر أساسية لكثير من المسارات في شبكة (البروتينات الاختناقات) 2-4. هذه التفاعلات تسمح الفيروسات لمعالجة العمليات الخلوية الهامة التي تلعب دورا محوريا لتكرار وإنتاج ذرية المعدية. أجريت المقارنة التفاعلات رسم الخرائط مؤخرا على الفيروسات ذات الصلة بهدف لاستخراج المعلومات المتعلقة4 المرضية. وعلاوة على ذلك، تم توسيع نطاق الدراسات من المضيف مسببات الأمراض تفاعلات المشهد لكثير من مسببات الأمراض 5. يوفر استهدفت خلية عوامل تحديد نظرة ثاقبة لالاستراتيجيات المستخدمة من قبل مسببات الأمراض أن تصيب الخلايا ويسمح الكشف عن علامات العدوى المحتملة.
نظام هجين اثنين الخميرة هي الطريقة الأكثر شعبية لتحديد التفاعلات الثنائية منذ الفحص الجيني هو أداة فعالة وحساسة لرسم الخرائط الإنتاجية العالية من البروتين البروتين التفاعلات. النهج المقترح هنا مزيد من يحسن غربلة Y2H الفردية من خلال تقييم البروتين من مسببات الأمراض متعددة المتغيرات سلالة، وبالتالي توفير إمكانية الوصول إلى نظرة شاملة مقارنة الممرض المضيف البروتين البروتين التفاعلات. وعلاوة على ذلك، وجود قيود كبيرة من الخميرة فحص هجين اثنين يكمن في معدل السلبية الكاذبة عالية، لأنه يسترد حوالي 20٪ من مجموع التفاعلات 6. هذا يعني أن التفاعلات مع الكشف عن مجموعة فرعية فقط من المرضيةجينز المتغيرات قد أفلتت من عملية الاكتشاف مع الآخرين. ولذلك، شركاء الفردية الناشئة من كل غربلة هجين اثنين وتحدى مزيد للتفاعل مع مجموعة كاملة من السلالات المدروسة، وتوفير قواعد البيانات التفاعل المقارنة. منذ وقد تبين أن الجمع بين منهجيات مختلفة يزيد بشدة متانة البروتين البروتين التفاعل مجموعات البيانات 7، يتم تنفيذ هذا التحقق في خلايا الثدييات التي وضعت حديثا البروتين شظية فحص تكامل دعا HT-GPCA 8. هذا النظام القائم على الخلية يسمح للكشف عن تفاعلات البروتين بواسطة تكامل من Gaussia princeps تقسيم و luciferase تم تصميمها لتكون متوافقة مع صيغة عالية الإنتاجية. وبفضل تقنيتها القائمة على التلألؤ والضوضاء لها خلفية منخفضة بالمقارنة مع غيرها من مقايسة المستندة إلى الإسفار، HT-GPCA يظهر حساسية عالية لافت للنظر.
وعموما، هذا النهج يشكل كفاءةأداة لتوليد مسح شامل لinterplays المضيف الممرض، الذي يمثل الخطوة الأولى نحو فهم عالمي من الخلية المضيفة الخطف.
Protocol
Representative Results
Discussion
بشكل مستقل، الخميرة اثنين والهجين والثدييات المقايسات التفاعل، مثل GST المنسدلة، LUMIER أو MAPPIT، أثبتت أنها أدوات فعالة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات، لكنها محدودة من ارتفاع معدل الكاذبة الإيجابية والسلبية الكاذبة التفاعلات المرتبطة مع هذه التقنيات 15. وعل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من التمويل من معهد باستور ومن المنح المقدمة من الدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (منح R05/75-129 وRS07/75-75)، والرابطة من أجل الديمقراطية بحوث السرطان سور جنيه (منح ARC A09 / 1/5031 و4867)، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR07 MIME 009 02 وANR09 سحنة 026 01). كان MM المستفيدة من زمالة MENRT.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
References
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
